TTchem-seq Protocol

TTchem-seq / DRB-TTchem-seq — Experimental Protocol

Source: Gregersen, Mitter & Svejstrup, Nature Protocols (2019), https://doi.org/10.1038/s41596-019-0262-3 This file keeps only the actionable materials/reagents/procedure/troubleshooting/timing content from the original paper (narrative/background sections removed).

Fig. 1a — TTchem-seq overview: in vivo 4SU labeling → total RNA extraction + yeast 4TU spike-in → RNA fragmentation → biotinylation → streptavidin pull-down → strand-specific library prep → sequencing → bioinformatics analysis.

Fig. 1b — DRB/TTchem-seq: 3.5 h DRB incubation synchronizes RNAPII near the TSS, then release + 10 min 4SU pulse at each of 10/20/30/40 min after release.

Key limits to keep in mind

Materials

Biological materials

Reagents

Equipment

Software

Reagent setup

CRITICAL Use RNase-free, molecular biology–grade materials and water for all solutions.

Procedure

A. Cell culture and 4SU labeling — Timing 24 h

  1. Seed cells at 50% confluency in a 10-cm dish, one dish per time point/sample/control; grow overnight (e.g., HEK293: high-glucose DMEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine). - CRITICAL STEP Always count cells to seed the same number each time (e.g., 2×10⁶ HEK293 cells/10-cm plate → ~50% confluency at seeding, ~70–80% next day; adjust per cell line). - Choose option A (TTchem-seq) or option B (DRB/TTchem-seq).

(A) TTchem-seq — 4SU only - (i) Add 4SU directly to medium to 1 mM final (e.g., 20 µL of 0.5 M 4SU into 10 mL medium), mix, incubate 15 min. - CRITICAL STEP Keep 4SU exposure time identical across all samples/controls. When processing many samples, stagger 4SU addition by 1 min per dish so each can be stopped at exactly the same elapsed time.

(B) DRB/TTchem-seq — DRB + 4SU - (i) Treat with 100 µM DRB for 3.5 h per time point (typically 10, 20, 30, 40 min after release); e.g. 10 µL of 100 mM DRB stock into 10 mL medium. - CRITICAL STEP Stagger DRB treatment/release times across samples to keep timing exact. - (ii) Release DRB with 3× washes of 10 mL pre-warmed (37 °C) PBS, then add pre-warmed fresh medium: - 10-min release: add fresh medium + 1 mM 4SU immediately after washes; label 10 min. - 20-min release: fresh medium without 4SU for 10 min, then add 4SU to 1 mM for the last 10 min. - 30-min release: fresh medium without 4SU for 20 min, then 4SU for the last 10 min. - 40-min release: fresh medium without 4SU for 30 min, then 4SU for the last 10 min. - CRITICAL STEP Keep the 4SU pulse exactly 10 min for every sample/control; stagger 4SU additions when processing multiple samples in parallel.

  1. Aspirate medium, stop labeling by adding 1 mL TRIzol per 10-cm dish (scale up for bigger dishes). Scrape cells with a cell lifter into a microcentrifuge tube. - ! CAUTION TRIzol is toxic — work in a fume hood; aspirate medium then quickly move the dish to the hood before adding TRIzol. - PAUSE POINT Cells in TRIzol: RT up to 30 min while collecting other samples, or −80 °C up to 1 year.

B. Total RNA extraction — Timing 4–5 h

  1. Add 200 µL chloroform per 1 mL TRIzol–cell mixture, shake 30 s, spin 12,000g, 15 min, 4 °C. - ! CAUTION fume hood. CRITICAL STEP TRIzol/chloroform + isopropanol precipitation is preferred over column kits (not limited to ~100 µg binding capacity).
  2. Spin phase-lock-gel tubes 12,000g, 20–30 s, RT to settle gel. Transfer upper aqueous phase from Step 3 onto the gel. Add equal volume chloroform/isoamyl alcohol (24:1). Shake, spin 12,000g, 5 min, 4 °C. - ! CAUTION fume hood. CRITICAL STEP phase-lock-gel tubes prevent organic-phase carryover.
  3. Transfer upper aqueous phase to a new tube, add 1.1 vol isopropanol, RT 20 min, spin 12,000g, 20 min, 4 °C to pellet RNA. - CRITICAL STEP Do not transfer any organic phase.
  4. Wash pellet in 750 µL 85% ethanol (don't disturb pellet), spin 7,500g, 5 min, 4 °C.
  5. Discard ethanol, air-dry pellet, resuspend in 50–100 µL RNase-free water. Measure concentration (Qubit RNA BR, expect >1 µg/µL) and check integrity (Bioanalyzer, Agilent RNA 6000 Nano Kit). - CRITICAL STEP Remove residual ethanol thoroughly (P1000 → quick spin 1,000g/RT/5s → P20 ultra-thin tip); air-dry until pellet edges look slightly transparent (~2–3 min) before resuspending. - CRITICAL STEP Use Qubit, not NanoDrop (NanoDrop overestimates RNA concentration) — accurate total-RNA quantitation is required for correct yeast spike-in dosing. (? TROUBLESHOOTING, see table) - PAUSE POINT Mammalian total 4SU-RNA: −80 °C up to 1 year.

C. Preparation of yeast 4SU-RNA spike-ins — Timing 24 h

  1. Grow 5-mL pre-culture of S. cerevisiae BY4741 in YPD (2% glucose) overnight at 30 °C, shaking.
  2. Dilute to OD600 = 0.1 in 50 mL, grow at 30 °C to OD600 = 0.8 (mid-log; usually 5–7 h).
  3. Label with 4TU to 5 mM final (e.g., 250 µL of 1 M stock into 50 mL culture), 5 min at 30 °C. Spin 500g, 5 min, 4 °C.
  4. Resuspend pellet in 300 µL enzymatic yeast RNA extraction buffer with lyticase, incubate 30 min at 30 °C.
  5. Purify RNA with PureLink RNA Mini Kit (yeast enzymatic protocol). Elute in 300 µL RNase-free water.
  6. Measure concentration (Qubit RNA BR; expect 500 ng/µL–1 µg/µL). PAUSE POINT −80 °C up to 1 year.

D. Assessment of 4SU incorporation by dot or slot blot — Timing 7 h

  1. Prepare 2–10 µg total RNA (from Step 7 or 13) per sample in 247 µL RNase-free water.
    • CRITICAL STEP Keep mammalian and yeast RNA separate for this assessment (yeast 4TU signal at 5 min ≫ mammalian 4SU signal at 10–15 min).
  2. Add 3 µL biotin buffer + 50 µL 0.1 mg/mL MTSEA biotin-XX linker (in DMF); RT, 30 min, dark.
  3. Purify biotinylated RNA on phase-lock-gel tubes with 250 µL phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1); spin 12,000g, 5 min, 4 °C; keep upper aqueous phase.
    • ! CAUTION fume hood. CRITICAL STEP Use phenol/chloroform, not column kits — kit buffers often contain reducing agents that cleave the biotin disulfide bond.
  4. Precipitate with 1/10 vol 5 M NaCl + 1.1 vol isopropanol; invert, RT 10 min.
  5. Spin 20,000g, 20 min, 4 °C; discard supernatant.
  6. Wash pellet in 500 µL 85% ethanol, spin 20,000g, 5 min, 4 °C.
    • CRITICAL STEP Remove residual ethanol thoroughly as in Step 7; air-dry ~2–3 min before resuspending.
  7. Reconstitute in 10 µL RNase-free water.
  8. Soak Hybond-N membrane + Whatman paper in RNase-free water; assemble in dot/slot blot apparatus; connect vacuum.
    • CRITICAL STEP Pre-wet membrane/paper, ensure a tight seal to prevent well-to-well diffusion.
  9. Load 10 µL sample (2–10 µg biotinylated RNA) per well.
    • CRITICAL STEP Optional 0.001% bromophenol blue helps visualize loading.
  10. Turn off vacuum, disassemble, mark membrane orientation (cut a corner).
  11. UV-crosslink at 0.2 J/cm² (254 nm).
    • CRITICAL STEP Keep UV dose constant, not exposure time (bulb output varies with warm-up).
  12. Block in dot/slot blot blocking buffer, 20 min, RT.
    • CRITICAL STEP Don't let blocking buffer get cold (SDS precipitates below RT).
  13. Probe with 1:50,000 HRP-streptavidin (1 mg/mL) in blocking buffer, 15 min, RT.
  14. Wash: 2× blocking buffer (10 min), 2× wash buffer I (10 min), 2× wash buffer II (10 min).
  15. Detect with ECL (dilute 1:5 if signal too strong).
    • CRITICAL STEP Yeast (4TU) signal is ~100× the mammalian (4SU) signal. (? TROUBLESHOOTING, see table)
  16. Stain for RNA loading with staining buffer, 10 min RT; de-stain with water washes (last wash can be overnight); image on a scanner.
    • CRITICAL STEP Wash enough to remove background but not so much that RNA stain is lost.

E. RNA fragmentation — Timing 1 h

  1. Mix 100 µg 4SU-labeled mammalian RNA (Step 7) + 1 µg yeast 4TU-RNA (Step 13) in 100 µL RNase-free water (on ice) per sample. Add 20 µL 1 M NaOH, incubate 20 min on ice.
    • CRITICAL STEP Same yeast spike-in amount in every sample; dilute yeast RNA to avoid <2 µL pipetting.
    • CRITICAL STEP Spike-ins are added to extracted RNA (not to the TRIzol–cell mixture, since cells can't be counted post-TRIzol); if per-cell RNA content is expected to change, base spike-in dosing on parallel cell counts instead.
    • CRITICAL STEP Ice incubation time controls fragment size; extend to 30–40 min for shorter fragments.
  2. Stop fragmentation with 80 µL 1 M Tris pH 6.8; proceed immediately to Micro Bio-Spin P-30 clean-up.
    • CRITICAL STEP Tris alone doesn't fully stop fragmentation — go straight to the columns.
  3. Prepare Micro Bio-Spin P-30 columns: invert to resuspend gel, snap tips, drain packing buffer by gravity (~2 min), then spin 1,000g, 2 min, RT to remove residual buffer.
  4. Apply 200 µL sample (from Step 31) to column center; spin 1,000g, 4 min, RT; collect flow-through.
  5. Repeat clean-up (new column) using all Step-33 eluate; collect final flow-through as fragmented RNA in Tris buffer.
    • CRITICAL STEP Two rounds are needed to fully neutralize pH and stop fragmentation.
    • PAUSE POINT On ice a few hours, or −80 °C up to 1 year.

F. Biotinylation of 4SU-RNA — Timing 2 h

  1. Add 3 µL biotin buffer + 50 µL 0.1 mg/mL MTSEA biotin-XX linker (in DMF) to the 200 µL fragmented RNA (Step 34); RT, 30 min, dark.
  2. Purify on phase-lock-gel tubes with 250 µL phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1); spin 12,000g, 5 min, 4 °C; keep aqueous phase.
    • ! CAUTION fume hood.
  3. Precipitate with 1/10 vol 5 M NaCl + 1.1 vol isopropanol; invert, RT 10 min.
  4. Spin 20,000g, 20 min, 4 °C; discard supernatant.
  5. Wash pellet in 500 µL 85% ethanol, spin 20,000g, 5 min, 4 °C, discard ethanol.
    • CRITICAL STEP Remove residual ethanol thoroughly, as in Step 7.
  6. Reconstitute in 50 µL RNase-free water. PAUSE POINT on ice a few hours, or −80 °C a few days.

G. Streptavidin pull-down of 4SU-RNA — Timing 2–3 h

  1. Denature biotinylated RNA (Step 40) 65 °C, 10 min; cool on ice 5 min.
  2. Add 200 µL µMACS streptavidin MicroBeads; rotate 15 min, RT.
  3. Rinse a µColumn (on the magnetic separator) with 100 µL nucleic acid equilibration buffer.
    • CRITICAL STEP Use a 2-mL syringe plunger to press out air bubbles and start flow.
  4. Load beads+RNA onto the column; magnetic beads retain, non-4SU RNA flows through (optionally collect as "non-4SU preexisting RNA").
    • CRITICAL STEP Keep the column on the magnet throughout washing/elution.
  5. Wash column 2× with 500 µL pre-warmed (55 °C) pull-down wash buffer.
  6. Elute with 100 µL elution buffer (RT); repeat after 5 min with another 100 µL; pool eluates.
    • CRITICAL STEP Prepare elution buffer immediately before use.
  7. Clean up/concentrate eluate(s) with RNeasy MinElute: for a 200-µL sample, add 700 µL RLT buffer + 1,050 µL 100% ethanol, apply over 3 rounds (700 µL onto column, spin 11,000g/30s/RT, discard flow-through, repeat), then follow Qiagen protocol. Elute in 15 µL RNase-free water.
    • CRITICAL STEP The extra ethanol (1.5× vs. standard protocol) is required to retain <200-nt fragments, which the standard MinElute protocol would discard.
  8. Check size on Bioanalyzer (Agilent RNA 6000 Pico Kit) — should match Step-34 fragment size. Measure concentration with Qubit RNA HS Assay Kit.
    • CRITICAL STEP Use Qubit, not NanoDrop. Typical yield: 200–700 ng 4SU-RNA per 100 µg total RNA (TTchem-seq); ~50–100 ng (DRB/TTchem-seq, due to RNAPII synchronization near TSS). (? TROUBLESHOOTING, see table)
    • PAUSE POINT −80 °C, up to a few weeks before library prep.

H. Strand-specific library preparation — Timing 2 d

  1. Prepare libraries from purified 4SU-RNA using any strand-specific, Illumina-compatible kit (e.g., KAPA Stranded RNA-Seq Library Prep Kit or KAPA RNA HyperPrep Kit + KAPA Dual-Indexed Adapter Kit). No further RNA fragmentation is needed — follow the kit's "degraded RNA" protocol: 30 s at 65 °C with 2× fragment/prime/elute buffer (KAPA Stranded) or 1 min at 65 °C (KAPA RNA HyperPrep), before first-strand synthesis.
    • CRITICAL STEP Best coverage from >50 ng 4SU-RNA input; typically start from ~100–300 ng (as little as 10 ng can work).
  2. Follow the kit's remaining steps. Optional test PCR to set cycle number: pause after 6 cycles, remove 10–20% aliquot, continue removing an aliquot every 2 cycles; run on 6% TBE gel with SYBR Gold; pick "two cycles before saturation" (typically 6–9 cycles total).
  3. QC the final library for concentration and size (typically 280–300 nt peak with KAPA kits). PAUSE POINT −20 °C, several months.

I. High-throughput sequencing — Timing 16 h

  1. Sequence single-end or paired-end, ~50–70 million reads/sample (HiSeq 2500/4000 or equivalent).
    • CRITICAL STEP 3–4 samples/lane on HiSeq 4000 for high-resolution single-gene profiles; more multiplexing (aiming ~30 million reads/sample) is OK if only metagene profiles are needed.

J. Bioinformatics analysis — Timing 2–5 d

  1. QC with FastQC (or similar).
    • CRITICAL STEP At 50–70 million reads/sample, expect >45–65 million mapped reads after trimming/alignment. Lower depth (e.g. 30 million) may work but is risky for single-gene conclusions, especially DRB/TTchem-seq at later time points.
  2. Alignment: build STAR genome indices for target (e.g. GRCh38) and spike-in (sacCer3) genomes; align with --quantMode GeneCounts (adjust for single-/paired-end); sort/index/mark-duplicates with SAMtools or Picard.
  3. Scale factors: build a yeast gene-count matrix from spike-in alignments (STAR *.ReadsPerGene.out.tab, or htseq-count / GenomicAlignments::summarizeOverlaps); pass to DESeq2's estimateSizeFactors. If counts aren't applicable, use total unique mapped reads instead.
  4. BigWig files: split target BAM into forward/reverse strand with SAMtools; convert each to a scaled BigWig with deepTools bamCoverage --scaleFactor.
    • (A) Metagene profiles (TTchem-seq): (i) build sense/antisense gene-body and TSS meta-profiles with ngs.plot –SS; for paired data, first restrict to mate-1 reads with SAMtools.
    • (B) RNAPII elongation rates (DRB/TTchem-seq only):
    • (i) Extended TSS meta-profiles: using R GRanges + GTF, build TSS-region intervals (−2 kb : +120 kb) for non-overlapping, 60–300 kb protein-coding genes (Ensembl gene view) on standard chromosomes; compute base-pair read-depth with bamsignals::bamCoverage; scale to RPM; take a 0.01-trimmed mean per bp.
    • (ii) Wave peak calling, metagene: fit smooth.spline (spar = 0.9) to each meta-profile; call the wave peak as the spline maximum; require peaks to advance monotonically with time.
    • (iii) Wave peak calling, single gene: same, per gene; filter out genes with total coverage <100 over the region, missing values, non-advancing peaks, or (optionally) a first-time-point peak <2 kb. Scripts: DRB-TTseq.R / DRB-TTseq.Rmd on https://github.com/crickbabs/DRB_TT-seq/releases/tag/v1.2
    • (iv) Elongation rate: linear fit of wave-peak position vs. time (kb/min); optionally include an assumed t=0, position=0 point.
    • CRITICAL STEP Reference scripts/data: https://github.com/crickbabs/DRB_TT-seq (release v1.2 zip includes code + data).

Troubleshooting

Step Problem Possible reason Solution
7 Degraded RNA before fragmentation RNase contamination Use clean tips/fresh RNase-free buffers; wear gloves; clean pipettes with RNaseZAP
28 No dot/slot blot signal Lack of 4SU incorporation Confirm 4SU concentration/storage (light-sensitive); use 200 µM 4SU overnight or 5-min 5 mM 4TU yeast labeling as positive control (~100× stronger signal)
28 No dot/slot blot signal No biotinylation of 4SU residues If the positive control also fails, biotinylation likely failed — remake MTSEA biotin-XX linker, store at −80 °C protected from light
48 No/low 4SU-RNA after pull-down Insufficient 4SU incorporation Check incorporation by dot/slot blot before pull-down; scale up starting material if yield <50 ng
48 No/low 4SU-RNA after pull-down Inactive biotin linker Aliquot MTSEA biotin-XX, store dark at −80 °C, use within a year
48 No/low 4SU-RNA after pull-down Poor elution Use freshly prepared elution buffer
— RNA fragments too short after hydrolysis Over-fragmentation Perform hydrolysis on ice; add 1 M Tris pH 6.8 immediately after the 20-min incubation and proceed straight to Micro Bio-Spin P-30 clean-up
— High background in non-4SU control Pull-down not stringent enough Pre-heat pull-down wash buffer to 55 °C (keep pre-heated aliquots); can add 2 washes in 8 M guanidinium chloride + 3 washes in TE (10 mM Tris pH 7.4, 1 mM EDTA) at 55 °C

Timing

Stage Steps Time
Cell culture and 4SU incorporation 1–2 24 h
Total RNA extraction 3–7 4–5 h
Yeast 4SU-RNA spike-in prep 8–13 24 h
Assessment of 4SU incorporation (dot/slot blot) 14–29 7 h
RNA fragmentation 30–34 1 h
Biotinylation of 4SU-RNA 35–40 2 h
Streptavidin pull-down of 4SU-RNA 41–48 2–3 h
Strand-specific library preparation 49–51 2 d
High-throughput sequencing 52 16 h
Bioinformatics analysis 53–56 2–5 d

Reference data

TTchem-seq / DRB-TTchem-seq — 实验操作规程（中文对照版）

来源：Gregersen, Mitter & Svejstrup, Nature Protocols (2019), https://doi.org/10.1038/s41596-019-0262-3 本文件仅保留原文中可直接用于实验操作的材料/试剂/步骤/排障/时间安排部分（已移除背景叙述），与 protocol.md 一一对应，专业名词、试剂名、货号、数值单位保持英文原文不译。

图 1a — TTchem-seq 总览：体内 4SU 标记 → 总 RNA 提取 + 酵母 4TU spike-in → RNA 片段化 → 生物素化 → streptavidin 富集 → 链特异性建库 → 测序 → 生信分析。

图 1b — DRB/TTchem-seq：DRB 孵育 3.5 h 使 RNAPII 同步聚集在 TSS 附近，随后释放并在释放后 10/20/30/40 min 各做 10 min 的 4SU 脉冲标记。

重要提示（务必牢记）

材料

生物材料

试剂

仪器设备

软件

试剂配制

关键：所有溶液均须使用无 RNase、分子生物学级材料和水。

实验步骤

A. 细胞培养与 4SU 标记 —— 用时 24 h

  1. 将细胞以 50% 融合度接种于 10-cm 培养皿，每个时间点/样本/对照各一皿，过夜培养（例如 HEK293：高糖 DMEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine）。 - 关键步骤 每次实验都要计数接种，保证细胞数一致（例如每 10-cm 皿接种 2×10⁶ 个 HEK293 细胞，接种时约 50% 融合度，次日约 70–80%；需根据细胞系调整）。 - 根据目的选择 方案 A（TTchem-seq）或 方案 B（DRB/TTchem-seq）。

（A）TTchem-seq —— 仅 4SU - (i) 将 4SU 直接加入培养基至终浓度 1 mM（例如 20 µL 0.5 M 4SU 加入 10 mL 培养基），混匀，孵育 15 min。 - 关键步骤 所有样本/对照的 4SU 孵育时间必须完全一致。多样本同时处理时，每皿间隔 1 min 加 4SU，以便在相同的经过时间点统一终止标记。

（B）DRB/TTchem-seq —— DRB + 4SU - (i) 每个时间点用 100 µM DRB 处理 3.5 h（通常做释放后 10、20、30、40 min 四个时间点）；例如 10 µL 100 mM DRB 母液加入 10 mL 培养基。 - 关键步骤 多个时间点应错开 DRB 处理/释放时间，以保证各样本计时精确。 - (ii) 用 3 次预热（37 °C）的 10 mL PBS 洗涤以解除 DRB 抑制，随后加入预热的新鲜培养基： - 10 min 释放：洗涤后立即加入含 1 mM 4SU 的新鲜培养基，标记 10 min。 - 20 min 释放：先加不含 4SU 的新鲜培养基孵育 10 min，再加 4SU 至 1 mM，标记最后 10 min。 - 30 min 释放：不含 4SU 培养基孵育 20 min，再加 4SU 标记最后 10 min。 - 40 min 释放：不含 4SU 培养基孵育 30 min，再加 4SU 标记最后 10 min。 - 关键步骤 每个样本/对照的 4SU 脉冲必须精确为 10 min；多样本并行处理时应错开加 4SU 的时间。

  1. 吸去培养基，每个 10-cm 皿加入 1 mL TRIzol 终止标记（大皿按比例增加）。用细胞刮刀将细胞刮入 TRIzol 混合液，收集到离心管中。 - ! 注意 TRIzol 有毒，须在通风橱内操作；先吸去培养基，再迅速将培养皿移入通风橱加入 TRIzol。 - 暂停点 细胞可在 TRIzol 中于 RT 保存最长 30 min（用于收集其他样本），或 −80 °C 长期保存（最长 1 年）。

B. 总 RNA 提取 —— 用时 4–5 h

  1. 每 1 mL TRIzol–细胞混合液加入 200 µL 氯仿，剧烈振荡 30 s，12,000g、15 min、4 °C 离心。 - ! 注意 通风橱操作。关键步骤 推荐用 TRIzol/氯仿抽提后异丙醇沉淀，而非柱式试剂盒（柱式通常限制在约 100 µg 结合容量）。
  2. 相分离凝胶管以 12,000g、20–30 s、RT 离心使凝胶沉底。将步骤 3 上层水相转移到凝胶管上层。加入等体积氯仿/异戊醇（24:1）。振荡后 12,000g、5 min、4 °C 离心。 - ! 注意 通风橱操作。关键步骤 相分离凝胶管可避免有机相污染。
  3. 将步骤 4 上层水相转移至新管，加入 1.1 倍体积异丙醇，RT 静置 20 min，12,000g、20 min、4 °C 离心沉淀 RNA。 - 关键步骤 切勿吸取有机相。
  4. 用 750 µL 85%（vol/vol）乙醇洗涤 RNA 沉淀（不要打散沉淀），7,500g、5 min、4 °C 离心。
  5. 弃去乙醇，风干沉淀，用 50–100 µL 无 RNase 水重悬。用 Qubit RNA BR Assay Kit 测浓度（应 >1 µg/µL），并用 Bioanalyzer（Agilent RNA 6000 Nano Kit）检查完整性。 - 关键步骤 彻底去除残余乙醇（先用 P1000 吸走大部分，快速离心 1,000g/RT/5 s，再用带超细吸头的 P20 吸尽剩余液体）；风干至沉淀边缘略透明（约 2–3 min）后再溶解。 - 关键步骤 必须用 Qubit 而非 NanoDrop 测浓度（NanoDrop 容易高估 RNA 浓度）——准确测定总 RNA 浓度对于正确加入酵母 spike-in 至关重要。（? 排障，见下表） - 暂停点 哺乳动物总 4SU-RNA 可于 −80 °C 保存最长 1 年。

C. 酵母 4SU-RNA spike-in 制备 —— 用时 24 h

  1. 将 S. cerevisiae BY4741 接种于 5 mL YPD（含 2% glucose）中，30 °C 摇床过夜（ON）培养预培养物。
  2. 将酵母培养物稀释至 OD600 = 0.1（50 mL 培养体系），30 °C 培养至 OD600 = 0.8（对数中期；通常需 5–7 h）。
  3. 加入 4TU 至终浓度 5 mM 进行标记（例如 250 µL 1 M 4TU 母液加入 50 mL 培养液），30 °C 标记 5 min。500g、5 min、4 °C 离心收集细胞。
  4. 将细胞沉淀重悬于 300 µL 含 lyticase 的酵母 RNA 酶解提取缓冲液中，转移至离心管，30 °C 孵育 30 min。
  5. 用 PureLink RNA Mini Kit（酵母酶解方案）按说明书纯化 RNA。用 300 µL 无 RNase 水洗脱。
  6. 用 Qubit RNA BR Assay Kit 测浓度（预期 500 ng/µL–1 µg/µL）。暂停点 −80 °C 可保存最长 1 年。

D. 通过 dot 或 slot blot 检测 4SU 掺入效率 —— 用时 7 h

  1. 每个样本取 2–10 µg 总 RNA（来自步骤 7 或 13），用无 RNase 水配至总体积 247 µL。
    • 关键步骤 检测阶段哺乳动物和酵母 RNA 样本须分开处理（酵母 5 min 的 4TU 信号远强于哺乳动物 10–15 min 的 4SU 信号）。
  2. 加入 3 µL biotin buffer + 50 µL 0.1 mg/mL MTSEA biotin-XX linker（溶于 DMF）；RT 避光孵育 30 min。
  3. 用相分离凝胶管配合 250 µL 苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）纯化生物素化 RNA；12,000g、5 min、4 °C 离心；保留上层水相。
    • ! 注意 通风橱操作。关键步骤 须用苯酚/氯仿而非柱式试剂盒纯化——试剂盒缓冲液常含还原剂，会切断生物素连接的二硫键。
  4. 加入 1/10 体积 5 M NaCl + 1.1 倍体积异丙醇沉淀；颠倒混匀，RT 静置 10 min。
  5. 20,000g、20 min、4 °C 离心；弃上清。
  6. 用 500 µL 85% 乙醇洗涤沉淀，20,000g、5 min、4 °C 离心。
    • 关键步骤 彻底去除残余乙醇，方法同步骤 7；风干约 2–3 min 后再溶解。
  7. 用 10 µL 无 RNase 水重悬沉淀。
  8. 将 Hybond-N 膜和 Whatman 滤纸在无 RNase 水中浸泡，装入 dot/slot blot 装置；接通真空泵。
    • 关键步骤 组装前须充分浸润膜和滤纸，并确保装置密封良好，防止样本在孔间扩散。
  9. 每孔加样 10 µL（含 2–10 µg 生物素化 RNA）。
    • 关键步骤 可加入 0.001%（wt/vol）溴酚蓝以帮助观察加样过程。
  10. 关闭真空泵，拆卸装置，剪去膜一角以标记方向。
  11. UV 交联，剂量 0.2 J/cm²（254 nm），使用 Stratalinker 或同类设备。
    • 关键步骤 应保持 UV 剂量 恒定而非照射时间恒定（灯管预热状态不同会影响实际剂量）。
  12. 用封闭液封闭膜，RT 孵育 20 min。
    • 关键步骤 封闭液温度不能过低（低于 RT 时 SDS 会析出沉淀）。
  13. 用 1:50,000 稀释的 1 mg/mL HRP-streptavidin（溶于封闭液）孵育膜，RT 15 min。
  14. 洗膜：封闭液洗 2 次（各 10 min），洗涤液 I 洗 2 次（各 10 min），洗涤液 II 洗 2 次（各 10 min）。
  15. 用 ECL 试剂显色检测（若信号过强可将 ECL 试剂用水稀释 1:5）。
    • 关键步骤 酵母（4TU）信号约为哺乳动物（4SU）信号的 ~100 倍。（? 排障，见下表）
  16. 用染色液对膜进行 RNA 上样量染色，RT 10 min；用水多次脱色（最后一次可过夜）；用扫描仪拍照记录。
    • 关键步骤 需洗去背景染色，但也不要过度洗涤以免把 RNA 本身的染色也洗掉。

E. RNA 片段化 —— 用时 1 h

  1. 每个样本将 100 µg 4SU 标记的哺乳动物 RNA（步骤 7）与 1 µg 酵母 4TU-RNA（步骤 13）混合于 100 µL 无 RNase 水中（置于冰上）。加入 20 µL 1 M NaOH，冰上孵育 20 min。
    • 关键步骤 各样本加入的酵母 spike-in 量必须一致；酵母 RNA 应事先稀释以避免移取体积 <2 µL。
    • 关键步骤 spike-in 加在提取后的 RNA 中（而非 TRIzol–细胞混合液中），因为 TRIzol 处理后无法再计数细胞；若预期细胞内 RNA 总量会变化，应改为按平行培养皿的细胞计数来加 spike-in。
    • 关键步骤 冰上孵育时间决定片段长度；如需更短片段，可延长至 30–40 min。
  2. 加入 80 µL 1 M Tris pH 6.8 终止片段化反应，并立即进行 Micro Bio-Spin P-30 纯化。
    • 关键步骤 单独加 Tris 不足以完全终止片段化——须立即上柱纯化。
  3. 制备 Micro Bio-Spin P-30 柱：颠倒使凝胶重悬，掰断柱尖，重力排出多余包装缓冲液（约 2 min），再 1,000g、2 min、RT 离心去除残余缓冲液。
  4. 将 200 µL 样本（来自步骤 31）加至柱中心；1,000g、4 min、RT 离心；收集流出液。
  5. 用新柱重复步骤 32–33 纯化流程（取步骤 33 全部洗脱液上样）；收集最终流出液，即 Tris 缓冲液中的片段化 RNA。
    • 关键步骤 须进行两轮纯化以确保 RNA 溶液恢复中性 pH，防止继续片段化。
    • 暂停点 可短期置于冰上（数小时），或 −80 °C 保存最长 1 年。

F. 4SU-RNA 生物素化 —— 用时 2 h

  1. 向步骤 34 所得 200 µL 片段化 RNA 中加入 3 µL biotin buffer + 50 µL 0.1 mg/mL MTSEA biotin-XX linker（溶于 DMF），混匀；RT 避光孵育 30 min。
  2. 用相分离凝胶管配合 250 µL 苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）纯化；12,000g、5 min、4 °C 离心；保留水相。
    • ! 注意 通风橱操作。
  3. 加入 1/10 体积 5 M NaCl + 1.1 倍体积异丙醇沉淀；颠倒混匀，RT 静置 10 min。
  4. 20,000g、20 min、4 °C 离心；弃上清。
  5. 用 500 µL 85% 乙醇洗涤沉淀，20,000g、5 min、4 °C 离心，弃乙醇。
    • 关键步骤 彻底去除残余乙醇，方法同步骤 7。
  6. 用 50 µL 无 RNase 水重悬。暂停点 可短期置于冰上（数小时），或 −80 °C 保存数天。

G. 4SU-RNA 的 Streptavidin 富集 —— 用时 2–3 h

  1. 将生物素化 RNA（步骤 40）65 °C 变性 10 min；冰上快速冷却 5 min。
  2. 加入 200 µL µMACS streptavidin MicroBeads，旋转孵育 15 min，RT。
  3. 将 µColumn 置于磁力分离架上，用 100 µL nucleic acid equilibration buffer 润洗柱子。
    • 关键步骤 用 2-mL 注射器活塞轻压柱顶以排出气泡并启动流动。
  4. 将磁珠+RNA 样本加至柱顶：磁珠会被固定在柱基质中，非 4SU-RNA 流出（可选择收集作为"非 4SU 标记的原有 RNA"）。
    • 关键步骤 整个洗涤和洗脱过程中须始终将柱保持在磁力架上。
  5. 用预热（55 °C）的 pull-down 洗涤液洗柱 2 次，每次 500 µL。
  6. 加入 100 µL 洗脱液（RT）洗脱 4SU-RNA 并收集洗脱液；5 min 后用另外 100 µL 洗脱液重复洗脱一次，合并两次洗脱液。
    • 关键步骤 洗脱液须现配现用。
  7. 用 RNeasy MinElute 对洗脱液进行纯化浓缩：以 200 µL 样本为例，加入 700 µL RLT buffer + 1,050 µL 100% 乙醇，分三次上样至柱（每次 700 µL 混合液上柱，11,000g/30 s/RT 离心，弃流出液，加入下一部分），随后按 Qiagen 说明书完成剩余步骤。用 15 µL 无 RNase 水洗脱。
    • 关键步骤 相较标准 RNeasy MinElute 方案，须多加 1.5×（vol/vol）乙醇才能保留 <200 nt 的片段（标准方案会丢弃这些小片段）。
  8. 用 Bioanalyzer（Agilent RNA 6000 Pico Kit）检查纯化后 4SU-RNA 的大小——应与步骤 34 片段化后的大小一致。用 Qubit RNA HS Assay Kit 测浓度以确定建库前浓度。
    • 关键步骤 须用 Qubit 而非 NanoDrop 测浓度。典型产量：TTchem-seq 每 100 µg 总 RNA 得 200–700 ng 4SU-RNA；DRB/TTchem-seq 由于 RNAPII 在 TSS 附近同步化，产量约 50–100 ng。（? 排障，见下表）
    • 暂停点 −80 °C 可保存数周，待建库。

H. 链特异性建库 —— 用时 2 d

  1. 用纯化的 4SU-RNA 制备高通量测序文库，可使用任意标准的链特异性、Illumina 兼容建库试剂盒（如 KAPA Stranded RNA-Seq Library Prep Kit，或 KAPA RNA HyperPrep Kit + KAPA Dual-Indexed Adapter Kit）。由于 RNA 已在前面片段化，建库过程无需再次片段化——按试剂盒的"降解 RNA"方案操作：一链合成前先用 2× fragment/prime/elute buffer 于 65 °C 孵育 30 s（KAPA Stranded）或 65 °C 孵育 1 min（KAPA RNA HyperPrep）。
    • 关键步骤 起始量 >50 ng 4SU-RNA 时覆盖度效果最佳；通常从 ~100–300 ng 起始（最少 10 ng 也可能成功）。
  2. 按试剂盒说明完成剩余建库步骤。可选做一次测试 PCR 来确定循环数：设置最终 PCR，在第 6 个循环后暂停，取出 10–20% 体积置于冰上，之后每隔 2 个循环再取一次；加 loading dye 后跑 6% TBE 胶，SYBR Gold 染色，UV 下观察；选择"饱和前两个循环"作为最终循环数（通常为 6–9 个循环）。
  3. 对最终文库进行常规质控，确定 DNA 浓度并确认片段大小（取决于 RNA 片段大小及试剂盒接头长度；用 KAPA 试剂盒典型峰值为 280–300 nt）。暂停点 −20 °C 可保存数月。

I. 高通量测序 —— 用时 16 h

  1. 以单端或双端模式测序（选择依据见原文 Introduction），每样本约 50–70 M reads（HiSeq 2500、HiSeq 4000 或其他兼容平台）。
    • 关键步骤 所需测序深度取决于下游分析和生物学问题。为获得高分辨率的单基因图谱（即使是低表达蛋白编码基因和 lncRNA），通常每条 lane 上样 3–4 个样本（HiSeq 4000）。若只需 metagene 图谱，可增加多重上样量，目标约 30 M reads/样本。

J. 生信分析 —— 用时 2–5 d

  1. 用 FastQC（或类似软件）评估文库质量。
    • 关键步骤 每样本测序深度为 50–70 M reads 时，经接头修剪和比对后预期获得 >45–65 M 有效比对 reads。较低深度（如 30 M）也可能可用，但基于单基因结论会更不可靠，尤其在 DRB/TTchem-seq 释放后期时间点信号更分散的情况下。
  2. 比对：为目标基因组（如 Homo sapiens GRCh38）和 spike-in 基因组（S. cerevisiae sacCer3）构建 STAR 基因组索引（结合现有基因注释）；用 STAR 加 --quantMode GeneCounts 参数进行比对（根据单端/双端调整）；用 SAMtools 或 Picard 对生成的 BAM 文件排序、建索引、标记重复。
  3. Scale factor 计算：该步骤利用酵母 spike-in 的 read 数为每个测序样本做归一化，计算假设各样本中 spike-in 等量存在的"scale factor"。用比对到 spike-in 的结果生成酵母基因水平计数矩阵，输入 Bioconductor DESeq2 包的 estimateSizeFactors 函数计算 scale factor。基因计数可来自各样本 spike-in 比对的 STAR 输出文件（*.ReadsPerGene.out.tab），或直接从 BAM 文件用 htseq-count 或 Bioconductor GenomicAlignments::summarizeOverlaps 生成计数矩阵。若计数信息不适用，可改用 BAM 文件中唯一比对 reads 总数来计算 scale factor。
  4. 生成 BigWig 文件：先用 SAMtools 将目标 BAM 文件拆分为正链和负链两个 BAM 文件；再用 deepTools 的 bamCoverage --scaleFactor 参数将每个链特异性 BAM 文件转换为经过 scale factor 校正的 BigWig 文件。若要制作 TTchem-seq 的 metagene 图谱用方案 A；若要计算 RNAPII 延伸速率用方案 B。
    • （A）TTchem-seq 的 metagene 图谱：(i) 基因体和 TSS meta-profile：用 ngs.plot 的 –SS 选项制作正义/反义链的基因体和 TSS 区域 meta-profile；若为双端数据，先用 SAMtools 将 BAM 文件限制为仅 mate 1 的 reads。
    • （B）RNAPII 延伸速率计算（仅 DRB/TTchem-seq）：
    • (i) 扩展 TSS meta-profile：用 R 的 GRanges 包和 GTF 基因注释文件，为标准染色体上长度 60–300 kb、互不重叠的蛋白编码基因（采用 Ensembl gene view，即合并所有转录本区间来定义基因边界）建立一组 TSS 区域基因组区间（−2 kb : +120 kb）。用 bamsignals::bamCoverage 函数从 BAM 文件计算这些区间上碱基级别的读段深度，将覆盖度归一化为 RPM（reads per million），并对每个碱基位置的 RPM 取 0.01 截尾均值。
    • (ii) Metagene 波峰计算：对每条扩展 TSS meta-profile 用 smooth.spline 函数拟合平滑样条（spar = 0.9）；将样条曲线的最大值点定义为波峰；仅保留波峰随时间推进（较晚时间点的波峰须位于较早时间点波峰之后）的样条区段。
    • (iii) 单基因波峰计算：原理与 metagene 波峰计算相同，但受限于单基因读段深度较低。对每个基因拟合平滑样条并将样条最大值处定义为波峰；随后过滤掉表达过低的基因（例如 −2 kb : +120 kb 区间总碱基覆盖度 <100）、存在缺失值的基因，以及波峰不随时间推进的基因；此外可选择性过滤掉首个时间点（如 10 min）波峰 <2 kb 的基因，以减少来自 TSS 区域的噪声（是否需要取决于所用的时间点设置；有时若预期转录已到达基因末端，生成过滤条件时可忽略最后一个时间点）。相关波峰计算函数见 R 脚本 DRB-TTseq.R，及对应的 R markdown 文档 DRB-TTseq.Rmd 和 HTML 文件（DRB-TTseq.html），可在 GitHub 页面获取：https://github.com/crickbabs/DRB_TT-seq/releases/tag/v1.2 和 https://github.com/crickbabs/DRB_TT-seq
    • (iv) 延伸速率计算：对计算得到的波峰位置随时间拟合线性模型，得到以 kb/min 为单位的延伸速率。若缺少 time = 0 的样本，可选择性地假设一个波峰位置为距 TSS 0 bp 的 time = 0 点纳入计算。相关计算函数见上述 GitHub 页面。
    • 关键步骤 TTchem-seq 和 DRB/TTchem-seq 分析的详细说明及示例脚本见：https://github.com/crickbabs/DRB_TT-seq/releases/tag/v1.2 和 https://github.com/crickbabs/DRB_TT-seq。该 release 页面还包含含全部代码和相关数据的 .zip 文件。

排障（Troubleshooting）

步骤 问题 可能原因 解决方案
7 片段化前 RNA 已降解 RNase 污染 使用洁净枪头和新鲜配制的无 RNase 缓冲液；操作时戴手套；用 RNaseZAP 清洁移液器
28 无 dot/slot blot 信号 4SU 掺入不足 确认加入细胞的 4SU 浓度正确；4SU 见光易分解，须避光保存；可用 200 µM 4SU 过夜标记或 5 min、5 mM 4TU 酵母标记作阳性对照（信号通常比哺乳动物强 ~100 倍）
28 无 dot/slot blot 信号 4SU 残基未被生物素化 若阳性对照（见上）也无信号，很可能是生物素化反应失败——重新配制 MTSEA biotin-XX linker，−80 °C 避光保存
48 Streptavidin 富集后无或极少 4SU-RNA 新合成 RNA 中 4SU 掺入不足 4SU 掺入效率因细胞系而异，应在做生物素标记和富集前先用 dot/slot blot 确认掺入效率是否足够；若产量仍过低（<50 ng），可能需要增加起始材料量
48 Streptavidin 富集后无或极少 4SU-RNA 生物素 linker 失活 分装 MTSEA biotin-XX linker，避光 −80 °C 保存，一年内用完
48 Streptavidin 富集后无或极少 4SU-RNA 4SU-RNA 从磁珠洗脱不佳 使用新鲜配制的洗脱液进行 4SU-RNA 洗脱
— 水解后 RNA 片段过短 RNA 过度片段化 确保受控 RNA 碱水解在冰上进行；20 min 孵育结束后立即加入 1 M Tris pH 6.8，并立即进行 Micro Bio-Spin P-30 柱纯化
— 非 4SU 对照中本底过高 4SU-RNA 纯化的严格程度不够 确保 pull-down 洗涤液预热至 55 °C（提前准备小份预热液，每次洗涤各用一份）；也可参考文献做法，在 1 M NaCl pull-down 洗涤液的两次洗涤基础上，增加两次 8 M 盐酸胍变性缓冲液洗涤，再于 55 °C 用 TE 缓冲液（10 mM Tris pH 7.4，1 mM EDTA）洗涤三次

时间安排

阶段 步骤 用时
细胞培养与 4SU 标记 1–2 24 h
总 RNA 提取 3–7 4–5 h
酵母 4SU-RNA spike-in 制备 8–13 24 h
dot/slot blot 检测 4SU 掺入效率 14–29 7 h
RNA 片段化 30–34 1 h
4SU-RNA 生物素化 35–40 2 h
Streptavidin 富集 4SU-RNA 41–48 2–3 h
链特异性建库 49–51 2 d
高通量测序 52 16 h
生信分析 53–56 2–5 d

参考数据

TTchem-seq / DRB-TTchem-seq — Experimental Protocol

Source: Gregersen, Mitter & Svejstrup, Nature Protocols (2019), https://doi.org/10.1038/s41596-019-0262-3 This file keeps only the actionable materials/reagents/procedure/troubleshooting/timing content from the original paper (narrative/background sections removed).

Fig. 1a — TTchem-seq overview: in vivo 4SU labeling → total RNA extraction + yeast 4TU spike-in → RNA fragmentation → biotinylation → streptavidin pull-down → strand-specific library prep → sequencing → bioinformatics analysis.

Fig. 1b — DRB/TTchem-seq: 3.5 h DRB incubation synchronizes RNAPII near the TSS, then release + 10 min 4SU pulse at each of 10/20/30/40 min after release.

TTchem-seq / DRB-TTchem-seq — 实验操作规程（中文对照版）

来源：Gregersen, Mitter & Svejstrup, Nature Protocols (2019), https://doi.org/10.1038/s41596-019-0262-3 本文件仅保留原文中可直接用于实验操作的材料/试剂/步骤/排障/时间安排部分（已移除背景叙述），与 protocol.md 一一对应，专业名词、试剂名、货号、数值单位保持英文原文不译。

图 1a — TTchem-seq 总览：体内 4SU 标记 → 总 RNA 提取 + 酵母 4TU spike-in → RNA 片段化 → 生物素化 → streptavidin 富集 → 链特异性建库 → 测序 → 生信分析。

图 1b — DRB/TTchem-seq：DRB 孵育 3.5 h 使 RNAPII 同步聚集在 TSS 附近，随后释放并在释放后 10/20/30/40 min 各做 10 min 的 4SU 脉冲标记。

Key limits to keep in mind

  • RNA fragmentation limits resolution to 25–500 nt fragments; increase base-hydrolysis time for smaller (higher-resolution) fragments. Size-exclusion clean-up excludes RNA <20 nt.
  • Longer 4SU pulse → more incorporated 4SU but more co-transcriptionally processed transcript; shorter pulse → more selective but too short a pulse gives poor library yield.
  • DRB/TTchem-seq elongation-rate analysis is only reliable for genes >60 kb (RNAPII wave has already moved 10–15 kb by 10 min post-release).
  • Typical yields: ~200–700 ng 4SU-RNA per 100 µg total RNA for standard TTchem-seq; ~50–100 ng for DRB/TTchem-seq.
  • Sequence to ~50–70 million reads/sample (single-end sufficient; paired-end needed only for co-transcriptional splicing info).

重要提示（务必牢记）

  • RNA 片段化后分辨率受限于 25–500 nt 的片段长度；若需更小片段（更高分辨率），延长碱水解时间。柱纯化会排除 <20 nt 的 RNA。
  • 4SU 脉冲越长，掺入量越高，但共转录加工（processing）比例也越高；脉冲越短越"新鲜"，但过短会导致掺入不足、建库质量差。
  • DRB/TTchem-seq 的延伸速率分析仅对 >60 kb 的基因可靠（释放后 10 min，RNAPII 波峰已推进 10–15 kb）。
  • 典型产量：标准 TTchem-seq 每 100 µg 总 RNA 得 ~200–700 ng 4SU-RNA；DRB/TTchem-seq 约 50–100 ng。
  • 测序深度建议每样本 ~50–70 M reads（单端已足够；双端仅在需要研究共转录剪接时才需要）。

Materials

材料

Biological materials

  • S. cerevisiae BY4741 (for spike-ins; Euroscarf, cat. no. Y00000)
  • Flp-In T-Rex 293 cell line (Thermo Fisher, cat. no. R78007, RRID: CVCL_U427) or another mammalian cell line of choice
  • ! CAUTION Routinely test for mycoplasma contamination.

生物材料

  • S. cerevisiae BY4741（用作 spike-in；Euroscarf, cat. no. Y00000）
  • Flp-In T-Rex 293 细胞系（Thermo Fisher, cat. no. R78007, RRID: CVCL_U427）或其他哺乳动物细胞系
  • ! 注意 应常规检测支原体污染。

Reagents

  • DMEM high-glucose GlutaMAX (Thermo Fisher, cat. no. 10566-016)
  • Fetal bovine serum (FBS; Gibco/Thermo Fisher, cat. no. 10270098)
  • L-Glutamine (200 mM, Thermo Fisher, cat. no. A2916801)
  • YPD broth (Thermo Fisher, cat. no. A1374501)
  • 4-thiouridine (4SU; Glentham Life Sciences, cat. no. GN6085)
  • 4-thiouracil (4TU; Sigma, cat. no. 440736)
  • DMSO, tissue-culture grade (Sigma-Aldrich, cat. no. D2650-5X5ML) — ! CAUTION irritant/flammable, wear gloves/goggles
  • Chloroform (Alfa Aesar/Thermo Fisher, cat. no. 43685) — ! CAUTION toxic/corrosive, use fume hood
  • Chloroform/isoamyl alcohol 24:1 (Sigma-Aldrich, cat. no. C0549) — ! CAUTION toxic/corrosive, use fume hood
  • TRIzol (Thermo Fisher, cat. no. 15596026) — ! CAUTION contains phenol, toxic, causes burns
  • Ethanol (VWR, cat. no. 24105) — ! CAUTION flammable
  • Lyticase from Arthrobacter luteus (Sigma-Aldrich, cat. no. L2524) — ! CAUTION may cause respiratory allergy, use P1 filter when weighing powder
  • EDTA (Fisher Scientific, cat. no. D/0700/53)
  • 2-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich, cat. no. M3148-25ML)
  • (Optional) Bromophenol blue (Sigma-Aldrich, cat. no. B0126)
  • PBS (VWR, cat. no. 45000)
  • SDS pellets (Sigma-Aldrich, cat. no. 75746)
  • ECL reagent (SuperSignal West Pico PLUS; Thermo Fisher, cat. no. 34580)
  • Sodium acetate (Thermo Fisher, cat. no. AM9740)
  • Methylene blue (Sigma-Aldrich, cat. no. M9140)
  • NaOH solution (Sigma-Aldrich, cat. no. 72068) — ! CAUTION corrosive
  • Trizma hydrochloride (Sigma-Aldrich, cat. no. 93363)
  • MTSEA biotin-XX linker (Biotium, cat. no. BT90066) — CRITICAL make 10× stock, 1 mg/mL in DMF, store −80 °C up to 6 months
  • DMF (Sigma-Aldrich, cat. no. D4551) — ! CAUTION toxic
  • Phenol/chloroform/isoamyl alcohol 25:24:1 (Thermo Fisher, cat. no. 15593031) — ! CAUTION toxic
  • NaCl (Sigma-Aldrich, cat. no. S3014)
  • Isopropanol (Fisher Scientific, cat. no. P/7500/PC17) — ! CAUTION flammable
  • µMACS Streptavidin Kit (Miltenyi, cat. no. 130-074-101) — CRITICAL prefer Miltenyi beads + µColumns for lower background
  • Tween 20 (Sigma-Aldrich, cat. no. P2287)
  • DTT (Sigma-Aldrich, cat. no. 10197777001) — ! CAUTION toxic if ingested
  • Qubit RNA BR Assay Kit (Thermo Fisher, cat. no. Q10210)
  • Qubit RNA HS Assay Kit (Thermo Fisher, cat. no. Q32852)
  • PureLink RNA Mini Kit (Thermo Fisher, cat. no. 12183020)
  • HRP-conjugated streptavidin (Thermo Fisher, cat. no. N100)
  • RNeasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen, cat. no. 74204)
  • Agilent RNA 6000 Pico Kit (cat. no. 5067-1513)
  • Agilent RNA 6000 Nano Kit (cat. no. 5067-1511)
  • Strand-specific RNA library prep kit (e.g., KAPA Stranded RNA-Seq Library Prep Kit, KAPA Biosystems cat. no. KR0934, or KAPA RNA HyperPrep Kit, Roche cat. no. 08098093702, + KAPA Dual-Indexed Adapter Kit, Roche cat. no. 08278555702)
  • DRB (Sigma-Aldrich, cat. no. D1916) — only needed for DRB/TTchem-seq

试剂

  • DMEM high-glucose GlutaMAX（Thermo Fisher, cat. no. 10566-016）
  • 胎牛血清 FBS（Gibco/Thermo Fisher, cat. no. 10270098）
  • L-Glutamine（200 mM, Thermo Fisher, cat. no. A2916801）
  • YPD 培养液（Thermo Fisher, cat. no. A1374501）
  • 4-thiouridine（4SU；Glentham Life Sciences, cat. no. GN6085）
  • 4-thiouracil（4TU；Sigma, cat. no. 440736）
  • DMSO，组织培养级（Sigma-Aldrich, cat. no. D2650-5X5ML）— ! 注意 刺激性/易燃，戴手套护目镜
  • 氯仿（Alfa Aesar/Thermo Fisher, cat. no. 43685）— ! 注意 有毒腐蚀，通风橱操作
  • 氯仿/异戊醇 24:1（Sigma-Aldrich, cat. no. C0549）— ! 注意 有毒腐蚀，通风橱操作
  • TRIzol（Thermo Fisher, cat. no. 15596026）— ! 注意 含苯酚，有毒，接触皮肤会灼伤
  • 乙醇（VWR, cat. no. 24105）— ! 注意 易燃
  • 来自 Arthrobacter luteus 的 Lyticase（Sigma-Aldrich, cat. no. L2524）— ! 注意 可能引起呼吸道过敏，称粉末时使用 P1 滤芯
  • EDTA（Fisher Scientific, cat. no. D/0700/53）
  • 2-mercaptoethanol（Sigma-Aldrich, cat. no. M3148-25ML）
  • （可选）溴酚蓝 Bromophenol blue（Sigma-Aldrich, cat. no. B0126）
  • PBS（VWR, cat. no. 45000）
  • SDS 颗粒（Sigma-Aldrich, cat. no. 75746）
  • ECL 试剂（SuperSignal West Pico PLUS；Thermo Fisher, cat. no. 34580）
  • 醋酸钠（Thermo Fisher, cat. no. AM9740）
  • 亚甲基蓝 Methylene blue（Sigma-Aldrich, cat. no. M9140）
  • NaOH 溶液（Sigma-Aldrich, cat. no. 72068）— ! 注意 腐蚀性
  • Trizma hydrochloride（Sigma-Aldrich, cat. no. 93363）
  • MTSEA biotin-XX linker（Biotium, cat. no. BT90066）— 关键 配成 10× 母液，1 mg/mL 溶于 DMF，−80 °C 保存最长 6 个月
  • DMF（Sigma-Aldrich, cat. no. D4551）— ! 注意 有毒
  • 苯酚/氯仿/异戊醇 25:24:1（Thermo Fisher, cat. no. 15593031）— ! 注意 有毒
  • NaCl（Sigma-Aldrich, cat. no. S3014）
  • 异丙醇（Fisher Scientific, cat. no. P/7500/PC17）— ! 注意 易燃
  • µMACS Streptavidin Kit（Miltenyi, cat. no. 130-074-101）— 关键 推荐使用 Miltenyi 磁珠配合 µColumns，本底更低
  • Tween 20（Sigma-Aldrich, cat. no. P2287）
  • DTT（Sigma-Aldrich, cat. no. 10197777001）— ! 注意 误食有毒
  • Qubit RNA BR Assay Kit（Thermo Fisher, cat. no. Q10210）
  • Qubit RNA HS Assay Kit（Thermo Fisher, cat. no. Q32852）
  • PureLink RNA Mini Kit（Thermo Fisher, cat. no. 12183020）
  • HRP 标记的 streptavidin（Thermo Fisher, cat. no. N100）
  • RNeasy MinElute Cleanup Kit（Qiagen, cat. no. 74204）
  • Agilent RNA 6000 Pico Kit（cat. no. 5067-1513）
  • Agilent RNA 6000 Nano Kit（cat. no. 5067-1511）
  • 链特异性 RNA 建库试剂盒（如 KAPA Stranded RNA-Seq Library Prep Kit, KAPA Biosystems cat. no. KR0934，或 KAPA RNA HyperPrep Kit, Roche cat. no. 08098093702 + KAPA Dual-Indexed Adapter Kit, Roche cat. no. 08278555702）
  • DRB（Sigma-Aldrich, cat. no. D1916）— 仅 DRB/TTchem-seq 需要

Equipment

  • 6% TBE gels (Thermo Fisher, cat. no. EC6265BOX)
  • SYBR Gold (Thermo Fisher, cat. no. S11494)
  • 6× DNA loading dye (Thermo Fisher, cat. no. R0611)
  • RNaseZAP (Sigma-Aldrich, cat. no. R2020)
  • MaXtract high-density phase-lock-gel tubes, 1.5 mL (Qiagen, cat. no. 129046) and 2 mL (cat. no. 129056)
  • Micro Bio-Spin P-30 gel columns, Tris pH 7.4 (Bio-Rad, cat. no. 732-6250)
  • Hybond-N membrane (GE Healthcare, cat. no. RPN203N)
  • Whatman paper (GE Healthcare, cat. no. 3030-917)
  • Cooling table-top centrifuge (Eppendorf 5427 R)
  • µMACS magnetic separator (Miltenyi, cat. no. 130-042-602) + MACS multistand (cat. no. 130-042-303)
  • Dot or slot blot apparatus (GE Healthcare PR 648 slot blot manifold)
  • Qubit fluorometer (Thermo Fisher Q33238)
  • Crosslinker, Stratalinker 2400 with 254-nm bulbs
  • 2100 Bioanalyzer (Agilent G2939BA)
  • PCR thermocycler (Bio-Rad T100, cat. no. 1861096)
  • Sequencer (Illumina HiSeq2500 or HiSeq4000)

仪器设备

  • 6% TBE 胶（Thermo Fisher, cat. no. EC6265BOX）
  • SYBR Gold（Thermo Fisher, cat. no. S11494）
  • 6× DNA loading dye（Thermo Fisher, cat. no. R0611）
  • RNaseZAP（Sigma-Aldrich, cat. no. R2020）
  • MaXtract 高密度相分离凝胶管，1.5 mL（Qiagen, cat. no. 129046）和 2 mL（cat. no. 129056）
  • Micro Bio-Spin P-30 凝胶柱，Tris pH 7.4（Bio-Rad, cat. no. 732-6250）
  • Hybond-N 膜（GE Healthcare, cat. no. RPN203N）
  • Whatman 滤纸（GE Healthcare, cat. no. 3030-917）
  • 冷冻台式离心机（Eppendorf 5427 R）
  • µMACS 磁力分离架（Miltenyi, cat. no. 130-042-602）+ MACS multistand（cat. no. 130-042-303）
  • Dot/slot blot 装置（GE Healthcare PR 648 slot blot manifold）
  • Qubit 荧光计（Thermo Fisher Q33238）
  • 交联仪，Stratalinker 2400，254-nm 灯管
  • 2100 Bioanalyzer（Agilent G2939BA）
  • PCR 仪（Bio-Rad T100, cat. no. 1861096）
  • 测序仪（Illumina HiSeq2500 或 HiSeq4000）

Software

  • SAMtools v.1.3.1
  • deepTools v.2.5.3
  • BEDTools v.2.27.1
  • kentUtils
  • STAR v.2.5.2a
  • Picard v.2.1.1
  • R v.3.5.1 + Bioconductor v.3.7
  • ngs.plot v.2.63
  • RStudio
  • FastQC
  • htseq-count
  • Analysis code/scripts: https://github.com/crickbabs/DRB_TT-seq (release https://github.com/crickbabs/DRB_TT-seq/releases/tag/v1.2)

软件

  • SAMtools v.1.3.1
  • deepTools v.2.5.3
  • BEDTools v.2.27.1
  • kentUtils
  • STAR v.2.5.2a
  • Picard v.2.1.1
  • R v.3.5.1 + Bioconductor v.3.7
  • ngs.plot v.2.63
  • RStudio
  • FastQC
  • htseq-count
  • 分析代码/脚本：https://github.com/crickbabs/DRB_TT-seq （release https://github.com/crickbabs/DRB_TT-seq/releases/tag/v1.2）

Reagent setup

CRITICAL Use RNase-free, molecular biology–grade materials and water for all solutions.

  • 4SU (0.5 M) stock: 1 g 4SU (MW 260.27) in 7.68 mL DMSO (or 250 mg in 1.92 mL). Aliquot 100–500 µL. Store −20 °C, dark, ≤12 months.
  • 4TU (1 M) stock: 1 g 4TU (MW 128.15) in 7.80 mL water. Aliquot 500 µL. Store −20 °C, dark, ≤12 months.
  • DRB (100 mM) stock (DRB/TTchem-seq only): 10 mg DRB (MW 319.14) in 313.3 µL DMSO. Aliquot 50 µL. Store −20 °C, dark, ≤12 months.
  • EDTA (0.5 M, pH 8.0): 186.12 g EDTA in 700 mL RNase-free water, pH to 8.0 with NaOH, top up to 1 L. RT, ≤12 months.
  • Tris-HCl (1 M), pH 6.8: 157.6 g Trizma-HCl in 700 mL water, pH to 6.8 with NaOH, top up to 1 L. RT, ≤12 months.
  • Tris-HCl (1 M), pH 7.4: same as above but pH to 7.4. RT, ≤12 months.
  • NaCl (5 M): 292 g NaCl to 1 L water. RT, ≤12 months.
  • Enzymatic yeast RNA extraction buffer: 0.8 M sorbitol, 0.1 M EDTA, 0.1% (vol/vol) 2-mercaptoethanol + lyticase to 200 U/mL (add fresh). For 100 mL without lyticase: 14.57 g sorbitol + 2.92 g EDTA in water to 99.9 mL + 100 µL 2-mercaptoethanol; RT ≤12 months. Add lyticase fresh (200 U/mL) just before use.
  • Biotin buffer: 833 mM Tris-HCl pH 7.4, 83.3 mM EDTA. 10 mL = 8.33 mL 1 M Tris-HCl pH 7.4 + 1.67 mL 0.5 M EDTA. RT, ≤12 months.
  • Dot/slot blot blocking buffer: 10% (wt/vol) SDS, 1 mM EDTA in PBS. 500 mL = 50 g SDS + 1 mL 0.5 M EDTA + PBS to 500 mL. RT, ≤12 months.
  • Dot/slot blot wash buffer I: 1% (wt/vol) SDS in PBS. 500 mL = 5 g SDS + PBS to 500 mL. RT, ≤12 months.
  • Dot/slot blot wash buffer II: 0.1% (wt/vol) SDS in PBS. 500 mL = 0.5 g SDS + PBS to 500 mL. RT, ≤12 months.
  • Dot/slot blot staining buffer: 0.5 M sodium acetate, 0.5% (wt/vol) methylene blue. 500 mL = 20.51 g sodium acetate + 250 mg methylene blue in water to 500 mL. RT, ≤12 months.
  • Pull-down wash buffer: 100 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% (vol/vol) Tween 20. 100 mL = 10 mL 1 M Tris-HCl pH7.4 + 2 mL 0.5 M EDTA + 20 mL 5 M NaCl + 100 µL Tween 20 + water to 100 mL. RT, ≤12 months.
  • Elution buffer: 100 mM DTT, freshly dissolved in RNase-free water (154 mg per 10 mL). Prepare immediately before use.

试剂配制

关键：所有溶液均须使用无 RNase、分子生物学级材料和水。

  • 4SU（0.5 M）母液：1 g 4SU（分子量 260.27）溶于 7.68 mL DMSO（或 250 mg 溶于 1.92 mL）。分装 100–500 µL/管。−20 °C 避光保存，≤12 个月。
  • 4TU（1 M）母液：1 g 4TU（分子量 128.15）溶于 7.80 mL 水。分装 500 µL/管。−20 °C 避光保存，≤12 个月。
  • DRB（100 mM）母液（仅 DRB/TTchem-seq 需要）：10 mg DRB（分子量 319.14）溶于 313.3 µL DMSO。分装 50 µL/管。−20 °C 避光保存，≤12 个月。
  • EDTA（0.5 M，pH 8.0）：186.12 g EDTA 溶于 700 mL 无 RNase 水，用 NaOH 调 pH 至 8.0，补水定容至 1 L。室温（RT）保存，≤12 个月。
  • Tris-HCl（1 M），pH 6.8：157.6 g Trizma-HCl 溶于 700 mL 水，用 NaOH 调 pH 至 6.8，补水定容至 1 L。RT，≤12 个月。
  • Tris-HCl（1 M），pH 7.4：同上，调 pH 至 7.4。RT，≤12 个月。
  • NaCl（5 M）：292 g NaCl 定容至 1 L 水。RT，≤12 个月。
  • 酵母 RNA 酶解提取缓冲液：0.8 M sorbitol、0.1 M EDTA、0.1%（vol/vol）2-mercaptoethanol + lyticase 至 200 U/mL（现配）。不含 lyticase 的 100 mL 配方：14.57 g sorbitol + 2.92 g EDTA 溶于水至 99.9 mL + 100 µL 2-mercaptoethanol；RT ≤12 个月保存。使用前现加 lyticase（200 U/mL）。
  • Biotin buffer：833 mM Tris-HCl pH 7.4，83.3 mM EDTA。10 mL = 8.33 mL 1 M Tris-HCl pH 7.4 + 1.67 mL 0.5 M EDTA。RT，≤12 个月。
  • Dot/slot blot 封闭液：10%（wt/vol）SDS，1 mM EDTA，溶于 PBS。500 mL = 50 g SDS + 1 mL 0.5 M EDTA + PBS 定容至 500 mL。RT，≤12 个月。
  • Dot/slot blot 洗涤液 I：1%（wt/vol）SDS 溶于 PBS。500 mL = 5 g SDS + PBS 定容至 500 mL。RT，≤12 个月。
  • Dot/slot blot 洗涤液 II：0.1%（wt/vol）SDS 溶于 PBS。500 mL = 0.5 g SDS + PBS 定容至 500 mL。RT，≤12 个月。
  • Dot/slot blot 染色液：0.5 M 醋酸钠，0.5%（wt/vol）亚甲基蓝。500 mL = 20.51 g 醋酸钠 + 250 mg 亚甲基蓝溶于水定容至 500 mL。RT，≤12 个月。
  • Pull-down 洗涤液：100 mM Tris-HCl pH 7.4，10 mM EDTA，1 M NaCl，0.1%（vol/vol）Tween 20。100 mL = 10 mL 1 M Tris-HCl pH7.4 + 2 mL 0.5 M EDTA + 20 mL 5 M NaCl + 100 µL Tween 20 + 水定容至 100 mL。RT，≤12 个月。
  • 洗脱液（Elution buffer）：100 mM DTT，现用无 RNase 水配制（每 10 mL 用 154 mg）。须现配现用。

Procedure

实验步骤

A. Cell culture and 4SU labeling — Timing 24 h

  1. Seed cells at 50% confluency in a 10-cm dish, one dish per time point/sample/control; grow overnight (e.g., HEK293: high-glucose DMEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine). - CRITICAL STEP Always count cells to seed the same number each time (e.g., 2×10⁶ HEK293 cells/10-cm plate → ~50% confluency at seeding, ~70–80% next day; adjust per cell line). - Choose option A (TTchem-seq) or option B (DRB/TTchem-seq).

(A) TTchem-seq — 4SU only - (i) Add 4SU directly to medium to 1 mM final (e.g., 20 µL of 0.5 M 4SU into 10 mL medium), mix, incubate 15 min. - CRITICAL STEP Keep 4SU exposure time identical across all samples/controls. When processing many samples, stagger 4SU addition by 1 min per dish so each can be stopped at exactly the same elapsed time.

(B) DRB/TTchem-seq — DRB + 4SU - (i) Treat with 100 µM DRB for 3.5 h per time point (typically 10, 20, 30, 40 min after release); e.g. 10 µL of 100 mM DRB stock into 10 mL medium. - CRITICAL STEP Stagger DRB treatment/release times across samples to keep timing exact. - (ii) Release DRB with 3× washes of 10 mL pre-warmed (37 °C) PBS, then add pre-warmed fresh medium: - 10-min release: add fresh medium + 1 mM 4SU immediately after washes; label 10 min. - 20-min release: fresh medium without 4SU for 10 min, then add 4SU to 1 mM for the last 10 min. - 30-min release: fresh medium without 4SU for 20 min, then 4SU for the last 10 min. - 40-min release: fresh medium without 4SU for 30 min, then 4SU for the last 10 min. - CRITICAL STEP Keep the 4SU pulse exactly 10 min for every sample/control; stagger 4SU additions when processing multiple samples in parallel.

  1. Aspirate medium, stop labeling by adding 1 mL TRIzol per 10-cm dish (scale up for bigger dishes). Scrape cells with a cell lifter into a microcentrifuge tube. - ! CAUTION TRIzol is toxic — work in a fume hood; aspirate medium then quickly move the dish to the hood before adding TRIzol. - PAUSE POINT Cells in TRIzol: RT up to 30 min while collecting other samples, or −80 °C up to 1 year.

A. 细胞培养与 4SU 标记 —— 用时 24 h

  1. 将细胞以 50% 融合度接种于 10-cm 培养皿，每个时间点/样本/对照各一皿，过夜培养（例如 HEK293：高糖 DMEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine）。 - 关键步骤 每次实验都要计数接种，保证细胞数一致（例如每 10-cm 皿接种 2×10⁶ 个 HEK293 细胞，接种时约 50% 融合度，次日约 70–80%；需根据细胞系调整）。 - 根据目的选择 方案 A（TTchem-seq）或 方案 B（DRB/TTchem-seq）。

（A）TTchem-seq —— 仅 4SU - (i) 将 4SU 直接加入培养基至终浓度 1 mM（例如 20 µL 0.5 M 4SU 加入 10 mL 培养基），混匀，孵育 15 min。 - 关键步骤 所有样本/对照的 4SU 孵育时间必须完全一致。多样本同时处理时，每皿间隔 1 min 加 4SU，以便在相同的经过时间点统一终止标记。

（B）DRB/TTchem-seq —— DRB + 4SU - (i) 每个时间点用 100 µM DRB 处理 3.5 h（通常做释放后 10、20、30、40 min 四个时间点）；例如 10 µL 100 mM DRB 母液加入 10 mL 培养基。 - 关键步骤 多个时间点应错开 DRB 处理/释放时间，以保证各样本计时精确。 - (ii) 用 3 次预热（37 °C）的 10 mL PBS 洗涤以解除 DRB 抑制，随后加入预热的新鲜培养基： - 10 min 释放：洗涤后立即加入含 1 mM 4SU 的新鲜培养基，标记 10 min。 - 20 min 释放：先加不含 4SU 的新鲜培养基孵育 10 min，再加 4SU 至 1 mM，标记最后 10 min。 - 30 min 释放：不含 4SU 培养基孵育 20 min，再加 4SU 标记最后 10 min。 - 40 min 释放：不含 4SU 培养基孵育 30 min，再加 4SU 标记最后 10 min。 - 关键步骤 每个样本/对照的 4SU 脉冲必须精确为 10 min；多样本并行处理时应错开加 4SU 的时间。

  1. 吸去培养基，每个 10-cm 皿加入 1 mL TRIzol 终止标记（大皿按比例增加）。用细胞刮刀将细胞刮入 TRIzol 混合液，收集到离心管中。 - ! 注意 TRIzol 有毒，须在通风橱内操作；先吸去培养基，再迅速将培养皿移入通风橱加入 TRIzol。 - 暂停点 细胞可在 TRIzol 中于 RT 保存最长 30 min（用于收集其他样本），或 −80 °C 长期保存（最长 1 年）。

B. Total RNA extraction — Timing 4–5 h

  1. Add 200 µL chloroform per 1 mL TRIzol–cell mixture, shake 30 s, spin 12,000g, 15 min, 4 °C. - ! CAUTION fume hood. CRITICAL STEP TRIzol/chloroform + isopropanol precipitation is preferred over column kits (not limited to ~100 µg binding capacity).
  2. Spin phase-lock-gel tubes 12,000g, 20–30 s, RT to settle gel. Transfer upper aqueous phase from Step 3 onto the gel. Add equal volume chloroform/isoamyl alcohol (24:1). Shake, spin 12,000g, 5 min, 4 °C. - ! CAUTION fume hood. CRITICAL STEP phase-lock-gel tubes prevent organic-phase carryover.
  3. Transfer upper aqueous phase to a new tube, add 1.1 vol isopropanol, RT 20 min, spin 12,000g, 20 min, 4 °C to pellet RNA. - CRITICAL STEP Do not transfer any organic phase.
  4. Wash pellet in 750 µL 85% ethanol (don't disturb pellet), spin 7,500g, 5 min, 4 °C.
  5. Discard ethanol, air-dry pellet, resuspend in 50–100 µL RNase-free water. Measure concentration (Qubit RNA BR, expect >1 µg/µL) and check integrity (Bioanalyzer, Agilent RNA 6000 Nano Kit). - CRITICAL STEP Remove residual ethanol thoroughly (P1000 → quick spin 1,000g/RT/5s → P20 ultra-thin tip); air-dry until pellet edges look slightly transparent (~2–3 min) before resuspending. - CRITICAL STEP Use Qubit, not NanoDrop (NanoDrop overestimates RNA concentration) — accurate total-RNA quantitation is required for correct yeast spike-in dosing. (? TROUBLESHOOTING, see table) - PAUSE POINT Mammalian total 4SU-RNA: −80 °C up to 1 year.

B. 总 RNA 提取 —— 用时 4–5 h

  1. 每 1 mL TRIzol–细胞混合液加入 200 µL 氯仿，剧烈振荡 30 s，12,000g、15 min、4 °C 离心。 - ! 注意 通风橱操作。关键步骤 推荐用 TRIzol/氯仿抽提后异丙醇沉淀，而非柱式试剂盒（柱式通常限制在约 100 µg 结合容量）。
  2. 相分离凝胶管以 12,000g、20–30 s、RT 离心使凝胶沉底。将步骤 3 上层水相转移到凝胶管上层。加入等体积氯仿/异戊醇（24:1）。振荡后 12,000g、5 min、4 °C 离心。 - ! 注意 通风橱操作。关键步骤 相分离凝胶管可避免有机相污染。
  3. 将步骤 4 上层水相转移至新管，加入 1.1 倍体积异丙醇，RT 静置 20 min，12,000g、20 min、4 °C 离心沉淀 RNA。 - 关键步骤 切勿吸取有机相。
  4. 用 750 µL 85%（vol/vol）乙醇洗涤 RNA 沉淀（不要打散沉淀），7,500g、5 min、4 °C 离心。
  5. 弃去乙醇，风干沉淀，用 50–100 µL 无 RNase 水重悬。用 Qubit RNA BR Assay Kit 测浓度（应 >1 µg/µL），并用 Bioanalyzer（Agilent RNA 6000 Nano Kit）检查完整性。 - 关键步骤 彻底去除残余乙醇（先用 P1000 吸走大部分，快速离心 1,000g/RT/5 s，再用带超细吸头的 P20 吸尽剩余液体）；风干至沉淀边缘略透明（约 2–3 min）后再溶解。 - 关键步骤 必须用 Qubit 而非 NanoDrop 测浓度（NanoDrop 容易高估 RNA 浓度）——准确测定总 RNA 浓度对于正确加入酵母 spike-in 至关重要。（? 排障，见下表） - 暂停点 哺乳动物总 4SU-RNA 可于 −80 °C 保存最长 1 年。

C. Preparation of yeast 4SU-RNA spike-ins — Timing 24 h

  1. Grow 5-mL pre-culture of S. cerevisiae BY4741 in YPD (2% glucose) overnight at 30 °C, shaking.
  2. Dilute to OD600 = 0.1 in 50 mL, grow at 30 °C to OD600 = 0.8 (mid-log; usually 5–7 h).
  3. Label with 4TU to 5 mM final (e.g., 250 µL of 1 M stock into 50 mL culture), 5 min at 30 °C. Spin 500g, 5 min, 4 °C.
  4. Resuspend pellet in 300 µL enzymatic yeast RNA extraction buffer with lyticase, incubate 30 min at 30 °C.
  5. Purify RNA with PureLink RNA Mini Kit (yeast enzymatic protocol). Elute in 300 µL RNase-free water.
  6. Measure concentration (Qubit RNA BR; expect 500 ng/µL–1 µg/µL). PAUSE POINT −80 °C up to 1 year.

C. 酵母 4SU-RNA spike-in 制备 —— 用时 24 h

  1. 将 S. cerevisiae BY4741 接种于 5 mL YPD（含 2% glucose）中，30 °C 摇床过夜（ON）培养预培养物。
  2. 将酵母培养物稀释至 OD600 = 0.1（50 mL 培养体系），30 °C 培养至 OD600 = 0.8（对数中期；通常需 5–7 h）。
  3. 加入 4TU 至终浓度 5 mM 进行标记（例如 250 µL 1 M 4TU 母液加入 50 mL 培养液），30 °C 标记 5 min。500g、5 min、4 °C 离心收集细胞。
  4. 将细胞沉淀重悬于 300 µL 含 lyticase 的酵母 RNA 酶解提取缓冲液中，转移至离心管，30 °C 孵育 30 min。
  5. 用 PureLink RNA Mini Kit（酵母酶解方案）按说明书纯化 RNA。用 300 µL 无 RNase 水洗脱。
  6. 用 Qubit RNA BR Assay Kit 测浓度（预期 500 ng/µL–1 µg/µL）。暂停点 −80 °C 可保存最长 1 年。

D. Assessment of 4SU incorporation by dot or slot blot — Timing 7 h

  1. Prepare 2–10 µg total RNA (from Step 7 or 13) per sample in 247 µL RNase-free water.
    • CRITICAL STEP Keep mammalian and yeast RNA separate for this assessment (yeast 4TU signal at 5 min ≫ mammalian 4SU signal at 10–15 min).
  2. Add 3 µL biotin buffer + 50 µL 0.1 mg/mL MTSEA biotin-XX linker (in DMF); RT, 30 min, dark.
  3. Purify biotinylated RNA on phase-lock-gel tubes with 250 µL phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1); spin 12,000g, 5 min, 4 °C; keep upper aqueous phase.
    • ! CAUTION fume hood. CRITICAL STEP Use phenol/chloroform, not column kits — kit buffers often contain reducing agents that cleave the biotin disulfide bond.
  4. Precipitate with 1/10 vol 5 M NaCl + 1.1 vol isopropanol; invert, RT 10 min.
  5. Spin 20,000g, 20 min, 4 °C; discard supernatant.
  6. Wash pellet in 500 µL 85% ethanol, spin 20,000g, 5 min, 4 °C.
    • CRITICAL STEP Remove residual ethanol thoroughly as in Step 7; air-dry ~2–3 min before resuspending.
  7. Reconstitute in 10 µL RNase-free water.
  8. Soak Hybond-N membrane + Whatman paper in RNase-free water; assemble in dot/slot blot apparatus; connect vacuum.
    • CRITICAL STEP Pre-wet membrane/paper, ensure a tight seal to prevent well-to-well diffusion.
  9. Load 10 µL sample (2–10 µg biotinylated RNA) per well.
    • CRITICAL STEP Optional 0.001% bromophenol blue helps visualize loading.
  10. Turn off vacuum, disassemble, mark membrane orientation (cut a corner).
  11. UV-crosslink at 0.2 J/cm² (254 nm).
    • CRITICAL STEP Keep UV dose constant, not exposure time (bulb output varies with warm-up).
  12. Block in dot/slot blot blocking buffer, 20 min, RT.
    • CRITICAL STEP Don't let blocking buffer get cold (SDS precipitates below RT).
  13. Probe with 1:50,000 HRP-streptavidin (1 mg/mL) in blocking buffer, 15 min, RT.
  14. Wash: 2× blocking buffer (10 min), 2× wash buffer I (10 min), 2× wash buffer II (10 min).
  15. Detect with ECL (dilute 1:5 if signal too strong).
    • CRITICAL STEP Yeast (4TU) signal is ~100× the mammalian (4SU) signal. (? TROUBLESHOOTING, see table)
  16. Stain for RNA loading with staining buffer, 10 min RT; de-stain with water washes (last wash can be overnight); image on a scanner.
    • CRITICAL STEP Wash enough to remove background but not so much that RNA stain is lost.

D. 通过 dot 或 slot blot 检测 4SU 掺入效率 —— 用时 7 h

  1. 每个样本取 2–10 µg 总 RNA（来自步骤 7 或 13），用无 RNase 水配至总体积 247 µL。
    • 关键步骤 检测阶段哺乳动物和酵母 RNA 样本须分开处理（酵母 5 min 的 4TU 信号远强于哺乳动物 10–15 min 的 4SU 信号）。
  2. 加入 3 µL biotin buffer + 50 µL 0.1 mg/mL MTSEA biotin-XX linker（溶于 DMF）；RT 避光孵育 30 min。
  3. 用相分离凝胶管配合 250 µL 苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）纯化生物素化 RNA；12,000g、5 min、4 °C 离心；保留上层水相。
    • ! 注意 通风橱操作。关键步骤 须用苯酚/氯仿而非柱式试剂盒纯化——试剂盒缓冲液常含还原剂，会切断生物素连接的二硫键。
  4. 加入 1/10 体积 5 M NaCl + 1.1 倍体积异丙醇沉淀；颠倒混匀，RT 静置 10 min。
  5. 20,000g、20 min、4 °C 离心；弃上清。
  6. 用 500 µL 85% 乙醇洗涤沉淀，20,000g、5 min、4 °C 离心。
    • 关键步骤 彻底去除残余乙醇，方法同步骤 7；风干约 2–3 min 后再溶解。
  7. 用 10 µL 无 RNase 水重悬沉淀。
  8. 将 Hybond-N 膜和 Whatman 滤纸在无 RNase 水中浸泡，装入 dot/slot blot 装置；接通真空泵。
    • 关键步骤 组装前须充分浸润膜和滤纸，并确保装置密封良好，防止样本在孔间扩散。
  9. 每孔加样 10 µL（含 2–10 µg 生物素化 RNA）。
    • 关键步骤 可加入 0.001%（wt/vol）溴酚蓝以帮助观察加样过程。
  10. 关闭真空泵，拆卸装置，剪去膜一角以标记方向。
  11. UV 交联，剂量 0.2 J/cm²（254 nm），使用 Stratalinker 或同类设备。
    • 关键步骤 应保持 UV 剂量 恒定而非照射时间恒定（灯管预热状态不同会影响实际剂量）。
  12. 用封闭液封闭膜，RT 孵育 20 min。
    • 关键步骤 封闭液温度不能过低（低于 RT 时 SDS 会析出沉淀）。
  13. 用 1:50,000 稀释的 1 mg/mL HRP-streptavidin（溶于封闭液）孵育膜，RT 15 min。
  14. 洗膜：封闭液洗 2 次（各 10 min），洗涤液 I 洗 2 次（各 10 min），洗涤液 II 洗 2 次（各 10 min）。
  15. 用 ECL 试剂显色检测（若信号过强可将 ECL 试剂用水稀释 1:5）。
    • 关键步骤 酵母（4TU）信号约为哺乳动物（4SU）信号的 ~100 倍。（? 排障，见下表）
  16. 用染色液对膜进行 RNA 上样量染色，RT 10 min；用水多次脱色（最后一次可过夜）；用扫描仪拍照记录。
    • 关键步骤 需洗去背景染色，但也不要过度洗涤以免把 RNA 本身的染色也洗掉。

E. RNA fragmentation — Timing 1 h

  1. Mix 100 µg 4SU-labeled mammalian RNA (Step 7) + 1 µg yeast 4TU-RNA (Step 13) in 100 µL RNase-free water (on ice) per sample. Add 20 µL 1 M NaOH, incubate 20 min on ice.
    • CRITICAL STEP Same yeast spike-in amount in every sample; dilute yeast RNA to avoid <2 µL pipetting.
    • CRITICAL STEP Spike-ins are added to extracted RNA (not to the TRIzol–cell mixture, since cells can't be counted post-TRIzol); if per-cell RNA content is expected to change, base spike-in dosing on parallel cell counts instead.
    • CRITICAL STEP Ice incubation time controls fragment size; extend to 30–40 min for shorter fragments.
  2. Stop fragmentation with 80 µL 1 M Tris pH 6.8; proceed immediately to Micro Bio-Spin P-30 clean-up.
    • CRITICAL STEP Tris alone doesn't fully stop fragmentation — go straight to the columns.
  3. Prepare Micro Bio-Spin P-30 columns: invert to resuspend gel, snap tips, drain packing buffer by gravity (~2 min), then spin 1,000g, 2 min, RT to remove residual buffer.
  4. Apply 200 µL sample (from Step 31) to column center; spin 1,000g, 4 min, RT; collect flow-through.
  5. Repeat clean-up (new column) using all Step-33 eluate; collect final flow-through as fragmented RNA in Tris buffer.
    • CRITICAL STEP Two rounds are needed to fully neutralize pH and stop fragmentation.
    • PAUSE POINT On ice a few hours, or −80 °C up to 1 year.

E. RNA 片段化 —— 用时 1 h

  1. 每个样本将 100 µg 4SU 标记的哺乳动物 RNA（步骤 7）与 1 µg 酵母 4TU-RNA（步骤 13）混合于 100 µL 无 RNase 水中（置于冰上）。加入 20 µL 1 M NaOH，冰上孵育 20 min。
    • 关键步骤 各样本加入的酵母 spike-in 量必须一致；酵母 RNA 应事先稀释以避免移取体积 <2 µL。
    • 关键步骤 spike-in 加在提取后的 RNA 中（而非 TRIzol–细胞混合液中），因为 TRIzol 处理后无法再计数细胞；若预期细胞内 RNA 总量会变化，应改为按平行培养皿的细胞计数来加 spike-in。
    • 关键步骤 冰上孵育时间决定片段长度；如需更短片段，可延长至 30–40 min。
  2. 加入 80 µL 1 M Tris pH 6.8 终止片段化反应，并立即进行 Micro Bio-Spin P-30 纯化。
    • 关键步骤 单独加 Tris 不足以完全终止片段化——须立即上柱纯化。
  3. 制备 Micro Bio-Spin P-30 柱：颠倒使凝胶重悬，掰断柱尖，重力排出多余包装缓冲液（约 2 min），再 1,000g、2 min、RT 离心去除残余缓冲液。
  4. 将 200 µL 样本（来自步骤 31）加至柱中心；1,000g、4 min、RT 离心；收集流出液。
  5. 用新柱重复步骤 32–33 纯化流程（取步骤 33 全部洗脱液上样）；收集最终流出液，即 Tris 缓冲液中的片段化 RNA。
    • 关键步骤 须进行两轮纯化以确保 RNA 溶液恢复中性 pH，防止继续片段化。
    • 暂停点 可短期置于冰上（数小时），或 −80 °C 保存最长 1 年。

F. Biotinylation of 4SU-RNA — Timing 2 h

  1. Add 3 µL biotin buffer + 50 µL 0.1 mg/mL MTSEA biotin-XX linker (in DMF) to the 200 µL fragmented RNA (Step 34); RT, 30 min, dark.
  2. Purify on phase-lock-gel tubes with 250 µL phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1); spin 12,000g, 5 min, 4 °C; keep aqueous phase.
    • ! CAUTION fume hood.
  3. Precipitate with 1/10 vol 5 M NaCl + 1.1 vol isopropanol; invert, RT 10 min.
  4. Spin 20,000g, 20 min, 4 °C; discard supernatant.
  5. Wash pellet in 500 µL 85% ethanol, spin 20,000g, 5 min, 4 °C, discard ethanol.
    • CRITICAL STEP Remove residual ethanol thoroughly, as in Step 7.
  6. Reconstitute in 50 µL RNase-free water. PAUSE POINT on ice a few hours, or −80 °C a few days.

F. 4SU-RNA 生物素化 —— 用时 2 h

  1. 向步骤 34 所得 200 µL 片段化 RNA 中加入 3 µL biotin buffer + 50 µL 0.1 mg/mL MTSEA biotin-XX linker（溶于 DMF），混匀；RT 避光孵育 30 min。
  2. 用相分离凝胶管配合 250 µL 苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）纯化；12,000g、5 min、4 °C 离心；保留水相。
    • ! 注意 通风橱操作。
  3. 加入 1/10 体积 5 M NaCl + 1.1 倍体积异丙醇沉淀；颠倒混匀，RT 静置 10 min。
  4. 20,000g、20 min、4 °C 离心；弃上清。
  5. 用 500 µL 85% 乙醇洗涤沉淀，20,000g、5 min、4 °C 离心，弃乙醇。
    • 关键步骤 彻底去除残余乙醇，方法同步骤 7。
  6. 用 50 µL 无 RNase 水重悬。暂停点 可短期置于冰上（数小时），或 −80 °C 保存数天。

G. Streptavidin pull-down of 4SU-RNA — Timing 2–3 h

  1. Denature biotinylated RNA (Step 40) 65 °C, 10 min; cool on ice 5 min.
  2. Add 200 µL µMACS streptavidin MicroBeads; rotate 15 min, RT.
  3. Rinse a µColumn (on the magnetic separator) with 100 µL nucleic acid equilibration buffer.
    • CRITICAL STEP Use a 2-mL syringe plunger to press out air bubbles and start flow.
  4. Load beads+RNA onto the column; magnetic beads retain, non-4SU RNA flows through (optionally collect as "non-4SU preexisting RNA").
    • CRITICAL STEP Keep the column on the magnet throughout washing/elution.
  5. Wash column 2× with 500 µL pre-warmed (55 °C) pull-down wash buffer.
  6. Elute with 100 µL elution buffer (RT); repeat after 5 min with another 100 µL; pool eluates.
    • CRITICAL STEP Prepare elution buffer immediately before use.
  7. Clean up/concentrate eluate(s) with RNeasy MinElute: for a 200-µL sample, add 700 µL RLT buffer + 1,050 µL 100% ethanol, apply over 3 rounds (700 µL onto column, spin 11,000g/30s/RT, discard flow-through, repeat), then follow Qiagen protocol. Elute in 15 µL RNase-free water.
    • CRITICAL STEP The extra ethanol (1.5× vs. standard protocol) is required to retain <200-nt fragments, which the standard MinElute protocol would discard.
  8. Check size on Bioanalyzer (Agilent RNA 6000 Pico Kit) — should match Step-34 fragment size. Measure concentration with Qubit RNA HS Assay Kit.
    • CRITICAL STEP Use Qubit, not NanoDrop. Typical yield: 200–700 ng 4SU-RNA per 100 µg total RNA (TTchem-seq); ~50–100 ng (DRB/TTchem-seq, due to RNAPII synchronization near TSS). (? TROUBLESHOOTING, see table)
    • PAUSE POINT −80 °C, up to a few weeks before library prep.

G. 4SU-RNA 的 Streptavidin 富集 —— 用时 2–3 h

  1. 将生物素化 RNA（步骤 40）65 °C 变性 10 min；冰上快速冷却 5 min。
  2. 加入 200 µL µMACS streptavidin MicroBeads，旋转孵育 15 min，RT。
  3. 将 µColumn 置于磁力分离架上，用 100 µL nucleic acid equilibration buffer 润洗柱子。
    • 关键步骤 用 2-mL 注射器活塞轻压柱顶以排出气泡并启动流动。
  4. 将磁珠+RNA 样本加至柱顶：磁珠会被固定在柱基质中，非 4SU-RNA 流出（可选择收集作为"非 4SU 标记的原有 RNA"）。
    • 关键步骤 整个洗涤和洗脱过程中须始终将柱保持在磁力架上。
  5. 用预热（55 °C）的 pull-down 洗涤液洗柱 2 次，每次 500 µL。
  6. 加入 100 µL 洗脱液（RT）洗脱 4SU-RNA 并收集洗脱液；5 min 后用另外 100 µL 洗脱液重复洗脱一次，合并两次洗脱液。
    • 关键步骤 洗脱液须现配现用。
  7. 用 RNeasy MinElute 对洗脱液进行纯化浓缩：以 200 µL 样本为例，加入 700 µL RLT buffer + 1,050 µL 100% 乙醇，分三次上样至柱（每次 700 µL 混合液上柱，11,000g/30 s/RT 离心，弃流出液，加入下一部分），随后按 Qiagen 说明书完成剩余步骤。用 15 µL 无 RNase 水洗脱。
    • 关键步骤 相较标准 RNeasy MinElute 方案，须多加 1.5×（vol/vol）乙醇才能保留 <200 nt 的片段（标准方案会丢弃这些小片段）。
  8. 用 Bioanalyzer（Agilent RNA 6000 Pico Kit）检查纯化后 4SU-RNA 的大小——应与步骤 34 片段化后的大小一致。用 Qubit RNA HS Assay Kit 测浓度以确定建库前浓度。
    • 关键步骤 须用 Qubit 而非 NanoDrop 测浓度。典型产量：TTchem-seq 每 100 µg 总 RNA 得 200–700 ng 4SU-RNA；DRB/TTchem-seq 由于 RNAPII 在 TSS 附近同步化，产量约 50–100 ng。（? 排障，见下表）
    • 暂停点 −80 °C 可保存数周，待建库。

H. Strand-specific library preparation — Timing 2 d

  1. Prepare libraries from purified 4SU-RNA using any strand-specific, Illumina-compatible kit (e.g., KAPA Stranded RNA-Seq Library Prep Kit or KAPA RNA HyperPrep Kit + KAPA Dual-Indexed Adapter Kit). No further RNA fragmentation is needed — follow the kit's "degraded RNA" protocol: 30 s at 65 °C with 2× fragment/prime/elute buffer (KAPA Stranded) or 1 min at 65 °C (KAPA RNA HyperPrep), before first-strand synthesis.
    • CRITICAL STEP Best coverage from >50 ng 4SU-RNA input; typically start from ~100–300 ng (as little as 10 ng can work).
  2. Follow the kit's remaining steps. Optional test PCR to set cycle number: pause after 6 cycles, remove 10–20% aliquot, continue removing an aliquot every 2 cycles; run on 6% TBE gel with SYBR Gold; pick "two cycles before saturation" (typically 6–9 cycles total).
  3. QC the final library for concentration and size (typically 280–300 nt peak with KAPA kits). PAUSE POINT −20 °C, several months.

H. 链特异性建库 —— 用时 2 d

  1. 用纯化的 4SU-RNA 制备高通量测序文库，可使用任意标准的链特异性、Illumina 兼容建库试剂盒（如 KAPA Stranded RNA-Seq Library Prep Kit，或 KAPA RNA HyperPrep Kit + KAPA Dual-Indexed Adapter Kit）。由于 RNA 已在前面片段化，建库过程无需再次片段化——按试剂盒的"降解 RNA"方案操作：一链合成前先用 2× fragment/prime/elute buffer 于 65 °C 孵育 30 s（KAPA Stranded）或 65 °C 孵育 1 min（KAPA RNA HyperPrep）。
    • 关键步骤 起始量 >50 ng 4SU-RNA 时覆盖度效果最佳；通常从 ~100–300 ng 起始（最少 10 ng 也可能成功）。
  2. 按试剂盒说明完成剩余建库步骤。可选做一次测试 PCR 来确定循环数：设置最终 PCR，在第 6 个循环后暂停，取出 10–20% 体积置于冰上，之后每隔 2 个循环再取一次；加 loading dye 后跑 6% TBE 胶，SYBR Gold 染色，UV 下观察；选择"饱和前两个循环"作为最终循环数（通常为 6–9 个循环）。
  3. 对最终文库进行常规质控，确定 DNA 浓度并确认片段大小（取决于 RNA 片段大小及试剂盒接头长度；用 KAPA 试剂盒典型峰值为 280–300 nt）。暂停点 −20 °C 可保存数月。

I. High-throughput sequencing — Timing 16 h

  1. Sequence single-end or paired-end, ~50–70 million reads/sample (HiSeq 2500/4000 or equivalent).
    • CRITICAL STEP 3–4 samples/lane on HiSeq 4000 for high-resolution single-gene profiles; more multiplexing (aiming ~30 million reads/sample) is OK if only metagene profiles are needed.

I. 高通量测序 —— 用时 16 h

  1. 以单端或双端模式测序（选择依据见原文 Introduction），每样本约 50–70 M reads（HiSeq 2500、HiSeq 4000 或其他兼容平台）。
    • 关键步骤 所需测序深度取决于下游分析和生物学问题。为获得高分辨率的单基因图谱（即使是低表达蛋白编码基因和 lncRNA），通常每条 lane 上样 3–4 个样本（HiSeq 4000）。若只需 metagene 图谱，可增加多重上样量，目标约 30 M reads/样本。

J. Bioinformatics analysis — Timing 2–5 d

  1. QC with FastQC (or similar).
    • CRITICAL STEP At 50–70 million reads/sample, expect >45–65 million mapped reads after trimming/alignment. Lower depth (e.g. 30 million) may work but is risky for single-gene conclusions, especially DRB/TTchem-seq at later time points.
  2. Alignment: build STAR genome indices for target (e.g. GRCh38) and spike-in (sacCer3) genomes; align with --quantMode GeneCounts (adjust for single-/paired-end); sort/index/mark-duplicates with SAMtools or Picard.
  3. Scale factors: build a yeast gene-count matrix from spike-in alignments (STAR *.ReadsPerGene.out.tab, or htseq-count / GenomicAlignments::summarizeOverlaps); pass to DESeq2's estimateSizeFactors. If counts aren't applicable, use total unique mapped reads instead.
  4. BigWig files: split target BAM into forward/reverse strand with SAMtools; convert each to a scaled BigWig with deepTools bamCoverage --scaleFactor.
    • (A) Metagene profiles (TTchem-seq): (i) build sense/antisense gene-body and TSS meta-profiles with ngs.plot –SS; for paired data, first restrict to mate-1 reads with SAMtools.
    • (B) RNAPII elongation rates (DRB/TTchem-seq only):
    • (i) Extended TSS meta-profiles: using R GRanges + GTF, build TSS-region intervals (−2 kb : +120 kb) for non-overlapping, 60–300 kb protein-coding genes (Ensembl gene view) on standard chromosomes; compute base-pair read-depth with bamsignals::bamCoverage; scale to RPM; take a 0.01-trimmed mean per bp.
    • (ii) Wave peak calling, metagene: fit smooth.spline (spar = 0.9) to each meta-profile; call the wave peak as the spline maximum; require peaks to advance monotonically with time.
    • (iii) Wave peak calling, single gene: same, per gene; filter out genes with total coverage <100 over the region, missing values, non-advancing peaks, or (optionally) a first-time-point peak <2 kb. Scripts: DRB-TTseq.R / DRB-TTseq.Rmd on https://github.com/crickbabs/DRB_TT-seq/releases/tag/v1.2
    • (iv) Elongation rate: linear fit of wave-peak position vs. time (kb/min); optionally include an assumed t=0, position=0 point.
    • CRITICAL STEP Reference scripts/data: https://github.com/crickbabs/DRB_TT-seq (release v1.2 zip includes code + data).

J. 生信分析 —— 用时 2–5 d

  1. 用 FastQC（或类似软件）评估文库质量。
    • 关键步骤 每样本测序深度为 50–70 M reads 时，经接头修剪和比对后预期获得 >45–65 M 有效比对 reads。较低深度（如 30 M）也可能可用，但基于单基因结论会更不可靠，尤其在 DRB/TTchem-seq 释放后期时间点信号更分散的情况下。
  2. 比对：为目标基因组（如 Homo sapiens GRCh38）和 spike-in 基因组（S. cerevisiae sacCer3）构建 STAR 基因组索引（结合现有基因注释）；用 STAR 加 --quantMode GeneCounts 参数进行比对（根据单端/双端调整）；用 SAMtools 或 Picard 对生成的 BAM 文件排序、建索引、标记重复。
  3. Scale factor 计算：该步骤利用酵母 spike-in 的 read 数为每个测序样本做归一化，计算假设各样本中 spike-in 等量存在的"scale factor"。用比对到 spike-in 的结果生成酵母基因水平计数矩阵，输入 Bioconductor DESeq2 包的 estimateSizeFactors 函数计算 scale factor。基因计数可来自各样本 spike-in 比对的 STAR 输出文件（*.ReadsPerGene.out.tab），或直接从 BAM 文件用 htseq-count 或 Bioconductor GenomicAlignments::summarizeOverlaps 生成计数矩阵。若计数信息不适用，可改用 BAM 文件中唯一比对 reads 总数来计算 scale factor。
  4. 生成 BigWig 文件：先用 SAMtools 将目标 BAM 文件拆分为正链和负链两个 BAM 文件；再用 deepTools 的 bamCoverage --scaleFactor 参数将每个链特异性 BAM 文件转换为经过 scale factor 校正的 BigWig 文件。若要制作 TTchem-seq 的 metagene 图谱用方案 A；若要计算 RNAPII 延伸速率用方案 B。
    • （A）TTchem-seq 的 metagene 图谱：(i) 基因体和 TSS meta-profile：用 ngs.plot 的 –SS 选项制作正义/反义链的基因体和 TSS 区域 meta-profile；若为双端数据，先用 SAMtools 将 BAM 文件限制为仅 mate 1 的 reads。
    • （B）RNAPII 延伸速率计算（仅 DRB/TTchem-seq）：
    • (i) 扩展 TSS meta-profile：用 R 的 GRanges 包和 GTF 基因注释文件，为标准染色体上长度 60–300 kb、互不重叠的蛋白编码基因（采用 Ensembl gene view，即合并所有转录本区间来定义基因边界）建立一组 TSS 区域基因组区间（−2 kb : +120 kb）。用 bamsignals::bamCoverage 函数从 BAM 文件计算这些区间上碱基级别的读段深度，将覆盖度归一化为 RPM（reads per million），并对每个碱基位置的 RPM 取 0.01 截尾均值。
    • (ii) Metagene 波峰计算：对每条扩展 TSS meta-profile 用 smooth.spline 函数拟合平滑样条（spar = 0.9）；将样条曲线的最大值点定义为波峰；仅保留波峰随时间推进（较晚时间点的波峰须位于较早时间点波峰之后）的样条区段。
    • (iii) 单基因波峰计算：原理与 metagene 波峰计算相同，但受限于单基因读段深度较低。对每个基因拟合平滑样条并将样条最大值处定义为波峰；随后过滤掉表达过低的基因（例如 −2 kb : +120 kb 区间总碱基覆盖度 <100）、存在缺失值的基因，以及波峰不随时间推进的基因；此外可选择性过滤掉首个时间点（如 10 min）波峰 <2 kb 的基因，以减少来自 TSS 区域的噪声（是否需要取决于所用的时间点设置；有时若预期转录已到达基因末端，生成过滤条件时可忽略最后一个时间点）。相关波峰计算函数见 R 脚本 DRB-TTseq.R，及对应的 R markdown 文档 DRB-TTseq.Rmd 和 HTML 文件（DRB-TTseq.html），可在 GitHub 页面获取：https://github.com/crickbabs/DRB_TT-seq/releases/tag/v1.2 和 https://github.com/crickbabs/DRB_TT-seq
    • (iv) 延伸速率计算：对计算得到的波峰位置随时间拟合线性模型，得到以 kb/min 为单位的延伸速率。若缺少 time = 0 的样本，可选择性地假设一个波峰位置为距 TSS 0 bp 的 time = 0 点纳入计算。相关计算函数见上述 GitHub 页面。
    • 关键步骤 TTchem-seq 和 DRB/TTchem-seq 分析的详细说明及示例脚本见：https://github.com/crickbabs/DRB_TT-seq/releases/tag/v1.2 和 https://github.com/crickbabs/DRB_TT-seq。该 release 页面还包含含全部代码和相关数据的 .zip 文件。

Troubleshooting

Step Problem Possible reason Solution
7 Degraded RNA before fragmentation RNase contamination Use clean tips/fresh RNase-free buffers; wear gloves; clean pipettes with RNaseZAP
28 No dot/slot blot signal Lack of 4SU incorporation Confirm 4SU concentration/storage (light-sensitive); use 200 µM 4SU overnight or 5-min 5 mM 4TU yeast labeling as positive control (~100× stronger signal)
28 No dot/slot blot signal No biotinylation of 4SU residues If the positive control also fails, biotinylation likely failed — remake MTSEA biotin-XX linker, store at −80 °C protected from light
48 No/low 4SU-RNA after pull-down Insufficient 4SU incorporation Check incorporation by dot/slot blot before pull-down; scale up starting material if yield <50 ng
48 No/low 4SU-RNA after pull-down Inactive biotin linker Aliquot MTSEA biotin-XX, store dark at −80 °C, use within a year
48 No/low 4SU-RNA after pull-down Poor elution Use freshly prepared elution buffer
— RNA fragments too short after hydrolysis Over-fragmentation Perform hydrolysis on ice; add 1 M Tris pH 6.8 immediately after the 20-min incubation and proceed straight to Micro Bio-Spin P-30 clean-up
— High background in non-4SU control Pull-down not stringent enough Pre-heat pull-down wash buffer to 55 °C (keep pre-heated aliquots); can add 2 washes in 8 M guanidinium chloride + 3 washes in TE (10 mM Tris pH 7.4, 1 mM EDTA) at 55 °C

排障（Troubleshooting）

步骤 问题 可能原因 解决方案
7 片段化前 RNA 已降解 RNase 污染 使用洁净枪头和新鲜配制的无 RNase 缓冲液；操作时戴手套；用 RNaseZAP 清洁移液器
28 无 dot/slot blot 信号 4SU 掺入不足 确认加入细胞的 4SU 浓度正确；4SU 见光易分解，须避光保存；可用 200 µM 4SU 过夜标记或 5 min、5 mM 4TU 酵母标记作阳性对照（信号通常比哺乳动物强 ~100 倍）
28 无 dot/slot blot 信号 4SU 残基未被生物素化 若阳性对照（见上）也无信号，很可能是生物素化反应失败——重新配制 MTSEA biotin-XX linker，−80 °C 避光保存
48 Streptavidin 富集后无或极少 4SU-RNA 新合成 RNA 中 4SU 掺入不足 4SU 掺入效率因细胞系而异，应在做生物素标记和富集前先用 dot/slot blot 确认掺入效率是否足够；若产量仍过低（<50 ng），可能需要增加起始材料量
48 Streptavidin 富集后无或极少 4SU-RNA 生物素 linker 失活 分装 MTSEA biotin-XX linker，避光 −80 °C 保存，一年内用完
48 Streptavidin 富集后无或极少 4SU-RNA 4SU-RNA 从磁珠洗脱不佳 使用新鲜配制的洗脱液进行 4SU-RNA 洗脱
— 水解后 RNA 片段过短 RNA 过度片段化 确保受控 RNA 碱水解在冰上进行；20 min 孵育结束后立即加入 1 M Tris pH 6.8，并立即进行 Micro Bio-Spin P-30 柱纯化
— 非 4SU 对照中本底过高 4SU-RNA 纯化的严格程度不够 确保 pull-down 洗涤液预热至 55 °C（提前准备小份预热液，每次洗涤各用一份）；也可参考文献做法，在 1 M NaCl pull-down 洗涤液的两次洗涤基础上，增加两次 8 M 盐酸胍变性缓冲液洗涤，再于 55 °C 用 TE 缓冲液（10 mM Tris pH 7.4，1 mM EDTA）洗涤三次

Timing

Stage Steps Time
Cell culture and 4SU incorporation 1–2 24 h
Total RNA extraction 3–7 4–5 h
Yeast 4SU-RNA spike-in prep 8–13 24 h
Assessment of 4SU incorporation (dot/slot blot) 14–29 7 h
RNA fragmentation 30–34 1 h
Biotinylation of 4SU-RNA 35–40 2 h
Streptavidin pull-down of 4SU-RNA 41–48 2–3 h
Strand-specific library preparation 49–51 2 d
High-throughput sequencing 52 16 h
Bioinformatics analysis 53–56 2–5 d

时间安排

阶段 步骤 用时
细胞培养与 4SU 标记 1–2 24 h
总 RNA 提取 3–7 4–5 h
酵母 4SU-RNA spike-in 制备 8–13 24 h
dot/slot blot 检测 4SU 掺入效率 14–29 7 h
RNA 片段化 30–34 1 h
4SU-RNA 生物素化 35–40 2 h
Streptavidin 富集 4SU-RNA 41–48 2–3 h
链特异性建库 49–51 2 d
高通量测序 52 16 h
生信分析 53–56 2–5 d

Reference data

  • All sequencing data: GEO accession GSE121826
  • Analysis code: https://github.com/crickbabs/DRB_TT-seq and https://github.com/crickbabs/DRB_TT-seq/releases/tag/v1.2

参考数据

  • 全部测序数据：GEO accession GSE121826
  • 分析代码：https://github.com/crickbabs/DRB_TT-seq 和 https://github.com/crickbabs/DRB_TT-seq/releases/tag/v1.2